犊牛口腔黏膜上皮细胞cDNA文库的构建及其水泡性口炎病毒受体的筛选

论文摘要

水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)是引起多种动物水泡性口炎的一种重要人兽共患病病原,属于弹状病毒科的成员。VSV对马、牛、猪特别易感,羊、山羊、多种野生动物和人均有易感性。水泡性口炎与口蹄疫、猪水泡病、猪水泡疹的临床症状十分相似,以口腔黏膜、舌、唇、乳头和蹄冠部上皮出现水泡为主要特征。VSV对不同动物致病性的共同特征为具有嗜上皮性,根据这一特性开展该病毒的致病机制研究,对于水泡性口炎疾病的防治意义重大。本研究以犊牛口腔黏膜上皮为材料,分离培养犊牛原代口腔黏膜上皮细胞,经形态学观察、细胞贴壁率和生长曲线计算、流式细胞仪检测等系统鉴定,确定已成功建立了一种原代犊牛口腔黏膜上皮细胞培养方法,并获得高纯度的原代上皮细胞,为研究具有嗜上皮性病毒的侵入机制和细胞cDNA文库构建提供了良好的实验体系。将VSV接种于犊牛口腔黏膜上皮细胞,应用超薄切片技术进行病毒的形态发生和细胞超微结构变化特征的观察,通过接毒细胞出现病变和电镜观察到弹状病毒样粒子,证实VSV可感染原代培养的犊牛口腔黏膜上皮细胞,并能繁殖扩增病毒。通过超微结构观察,初步明确VSV对该细胞的侵袭过程,且病毒通过细胞膜和胞浆内的空泡膜上出芽增殖后获得囊膜而成熟。将原代细胞大量培养增殖后,提取细胞的总RNA后分离其mRNA,利用噬菌体表面展示技术,构建了对VSV具有高反应性的CPMBCs高质量cDNA表达文库。未扩增文库的滴度为1.3×107 pfu/mL,文库重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.4×1010 pfu/mL。为高通量地从库中筛选出与VSV相互作用的噬菌体重组子,即寻找该病毒相互作用受体蛋白奠定了坚实的基础。用纯化的VSV与构建的T7噬菌体展示文库进行文库筛选,获得一个VSV可能的受体蛋白基因功能区片段。该基因片段长度为801bp,含有一大小为375bp的开放阅读框,编码124个氨基酸残基,将其命名为CPMBCsCP1。测序结果经登陆NCBI BLAST核酸同源性检索为与人类的剪接因子3b的同源性较高。DNAStar软件和ScanProsite分析结果表明是CPMBCsCP1蛋白亲水性较好,具有免疫原性和良好的抗原性,其生物学活性有可能在细胞信号传导通路中接受多种信号的调控。该项研究不仅为VSV由其受体介导的分子致病机制研究奠定坚实的基础,而且将为我国针对VSV引发疾病的防治研究提供参考依据。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 水泡性口炎病毒研究进展
• 1 VSV的形态结构及化学组成
• 2 VSV基因组成、结构蛋白及其功能
• 3 VSV的分子致病机制
• 4 水泡性口炎病毒的检测技术
• 5 VSV在抗病毒、抗肿瘤方面的应用
• 6 结语
• 第二章 病毒细胞膜受体的筛选与鉴定研究进展
• 1 病毒受体的生物学特性及其功能
• 2 病毒受体的筛选与鉴定方法
• 3 结语
• 第三章 噬菌体展示技术的研究进展
• 1 噬菌体展示技术的产生
• 2 噬菌体展示技术的原理
• 3 噬菌体展示技术的特点
• 4 噬菌体系统的种类
• 5 噬菌体展示文库的种类
• 6 噬菌体展示文库的筛选
• 7 噬菌体展示文库的应用
• 第二篇 研究内容
• 第一章 新生犊牛口腔黏膜上皮细胞的原代培养
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 水泡性口炎病毒感染犊牛口腔黏膜上皮细胞的超微结构变化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 CPMBCs cDNA噬菌体展示文库的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 水泡性口炎病毒CPMBCs膜受体的初步筛选
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的学术论文
• 致谢
• 导师及作者简介
• 中文摘要
• Abstract