调控子Fur直接调控鼠疫耶尔森氏菌铁代谢功能的研究

论文摘要

鼠疫是一种古老的自然疫源性疾病,是由鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）引起的。而铁的摄取与利用在细菌生长和毒性中起重要作用。铁摄取调节蛋白（Fur）是革兰氏阴性菌重要的调节子,它调控细菌对铁的摄取和利用。虽然研究发现多个铁摄取系统受Fur调节,但是至今还没有从整体上阐明Fur如何调节鼠疫菌铁代谢。本研究首先基于Red系统一步法缺失替换鼠疫菌的fur基因,利用鼠疫全基因组DNA芯片进行基因转录调控的研究。为了鉴定铁-Fur调控元,我们比较了野生株在铁缺乏与铁富余条件下、以及铁富余条件下野生株与fur突变株的全局表达谱的变化。这一分析可以从全基因组水平上筛选出所有受铁-Fur直接或间接调控的靶基因。然后,在表达谱分析基础上进一步通过凝胶迁移实验、足迹实验、RT-PCR和引物延伸实验等这些经典分子生化实验和生物信息学分析,鉴定出受铁-Fur直接调控的操纵子,从而深入探究Fur对鼠疫菌铁代谢转录调控的分子机制。研究表明有32个操纵子/基因受铁-Fur直接调控,其中有29个转录下调,3个上调。根据功能可将这些操纵子/基因分为五类:铁的摄取;运输;贮存;少数与鼠疫菌铁摄取无关但与侵袭相关;还有少数基因功能未知。为了明确Fur的精细调控机制,本研究对这些操纵子/基因进行生物信息学计算分析,预测其启动子区与Fur的结合基序,并用DNaseI足迹实验进行验证。信息学预测与生化实验结果结合得出鼠疫菌Fur box并与大肠杆菌的Fur box进行了比较。鼠疫耶尔森氏菌染色体上有一段102Kb的DNA区域,为pgm位点,它分成两个相邻部分:一个是hms位点,决定血红素储存功能;另一区域包含4个操纵子（fyuA, irp2-irp1-ybtUTE, ybtA,和ybtPQXS）,与小肠结肠炎耶尔森氏菌强毒力岛（high pathogenicity island, HPI）中相应基因同源,称作耶氏杆菌素（Ybt）系统,属于铁载体依赖性离子转运系统,与鼠疫菌毒力相关。在已有文献以及实验分析基础上,我们构建了鼠疫菌Fur和YbtA对HPI转录调控的网络。HPI在耶尔森氏菌属中是高度保守的,因而所研究的鼠疫菌Fur和YbtA对HPI转录调控机制在耶尔森氏菌属中应该是普遍适用的。本研究首次从整体上鉴定了鼠疫菌受铁-Fur直接调控的调控元,同时从分子水平上明确了鼠疫菌Fur box的特性。本研究界定Fur调控元,探究了Fur转录调控机制,着重构建了鼠疫菌Fur和YbtA对HPI转录调控的网络,为进一步明确这些调控元的功能以及它们在鼠疫菌铁代谢中协同作用的机制提供了实验证据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1. 鼠疫动物流行病学特征
• 2. 鼠疫菌的病原学特征
• 2.1 生理生化特性
• 2.2 基因组的结构
• 2.3 毒力决定因子
• 3. 革兰氏阴性菌的铁获得
• 3.1 铁的作用和特性
• 3.2 基于铁载体的铁获得
• 2+的运输和Fe³⁺的还原'>3.3 Fe²⁺的运输和Fe³⁺的还原
• 4. 革兰氏阴性菌的铁储存
• 4.1 铁贮存蛋白的种类和结构
• 4.2 铁贮存蛋白的功能特点
• 5. 铁与氧化还原应激
• 6. Fur蛋白对革兰氏阴性菌铁代谢的整体调控
• 6.1 Fur 蛋白的结构特点
• 6.2 与Fur 蛋白结合的Fur box 鉴定
• 7. 基因转录调控的研究策略
• 8. 本研究的目的
• 正文
• 1. 材料
• 1.1 菌株，质粒
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 质粒
• 1.2 酶，试剂盒
• 1.3 试剂，溶液，药品
• 1.4 主要仪器
• 2. 方法
• 2.1 △fur 突变株的构建
• 2.1.1 突变盒引物的设计与突变盒的扩增
• 2.1.2 感受态细胞的制备
• 2.1.3 电转化
• 2.1.4 重组克隆的筛选鉴定
• 2.2 比较表达谱芯片的制备
• 2.2.1 鼠疫菌总RNA 的提取
• 2.2.2 总RNA 的荧光素标记
• 2.2.3 芯片杂交与数据分析
• 2.2.4 铁缺乏刺激元与Fur调控元的鉴定
• 2.3 Fur 蛋白的克隆，表达，纯化
• 2.3.1 引物设计与合成
• 2.3.2 产物扩增与连接
• 2.3.3 连接产物转化
• 2.3.4 阳性克隆的筛选与目的蛋白的表达
• 2.3.5 目的蛋白的纯化
• 2.3.6 His-Fur 蛋白上His 标签的去除
• 2.3.7 蛋白浓度的测定
• 2.4 凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assays,EMSA）
• 2.4.1 目的 DNA 片段的合成
• 2.4.2 探针的标记
• 2.4.3 结合百分比的测定
• 2.4.4 未结合标记物的去除
• 2.4.5 结合反应
• 2.5 DNA 酶I 足迹实验（DNase I footprinting assays）
• 2.5.1 寡核苷酸序列5’平末端标记
• 2.5.2 PCR 及PCR 产物的纯化
• 2.5.3 结合反应
• 2.5.4 足迹实验
• 2.5.5 Fur 结合位点的生物信息学分析
• 2.6 引物延伸实验（primer extension assays）
• 2.6.1 与靶基因m RNA 互补引物的设计
• 2.6.2 总RNA的提取
• 2.6.3 寡核苷酸探针的制备
• 2.6.4 引物延伸反应
• 2.7 测序反应
• 2.7.1 寡核苷酸引物的标记
• 2.7.2 延伸/终止反应
• 2.8 实时定量逆转录（RT-PCR）
• 2.8.1 Trizol 提取细菌RNA 的方法
• TM kit 去DNA 污染'>2.8.2 Ambion’s DNA-free^TM kit 去DNA 污染
• 2.8.3 逆转录生成cDNA
• 2.8.4 RT-PCR 反应
• 3. 结果
• 3.1 Fur 蛋白表达纯化与 His 标签的去除
• 3.2 分子生化实验
• 3.2.1 凝胶迁移实验（EMSA）
• 3.2.2 DNA 酶I 足迹实验
• 3.2.3 引物延伸实验
• 3.2.4 RT-PCR
• 4. 讨论
• 4.1 鼠疫菌的整体铁调控子-铁摄取调控蛋白（Fur）调控分析
• 4.1.1 Fur调控的机制
• 4.1.2 Fur是一个整体调控子
• 4.1.3 鼠疫菌的铁摄取系统存在差异表达
• 4.1.4 除Ybt 系统外其它主要铁和血红素转运系统
• 4.1.5 为铁获得提供能量的TonB-ExbB-ExbD 复合体
• 4.2 铁摄取调控蛋白（Fur）结合位点比较分析
• 4.3 铁摄取调控蛋白（Fur）与YbtA 调控网络的构建
• 4.3.1 对Ybt系统研究的分析总结
• 4.3.2 Fur/YbtA 调控网络构建
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在学期间学术成果情况