猪SLA-DRA、SLA-DRB基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

论文摘要

首先根据GenBank登录的SLA-DRA和SLA-DRB基因序列设计特异性引物,引物两端分别加上BamH I铂Xho I酶切位点及保护碱基。通过反转录聚合酶链式反应（PT-PCR）技术,从长白猪肠系淋巴结组织总RNA中扩增出两条特异性基因片段。PCR产物分离纯化后连接到pMD18-T载体,经菌液PCR和双酶切反应筛选出阳性重组克隆后进行序列测定。结果表明本试验成功克隆了SLA-DRA和SLA-DRB基因,两者分别由759和801个核苷酸组成,分别编码252和266个氨基酸。对SLA-DRA和SLA-DRB的结构和功能进行生物信息学预测,发现SLA-DRA氨基酸序列中有2个潜在的N-糖基化位点,Asn141、Asn244可被糖基化,SLA-DRB氨基酸序列中有1个潜在的N-糖基化位点,Asn48可被糖基化。SLA-DRA有4个主要的疏水区,SLA-DRB表现出较强的亲水性。SLA-DRA氨基酸序列中有12个潜在的磷酸化位点:Ser38、Ser42、Ser 116、Ser156、Ser179、Thr64、Thr97、Thr207、Thr216、Thr246、Tyr36和Tyr184,SLA-DRB氨基酸序列中有13个潜在的磷酸化位点:Ser71、Ser92、Ser196、Ser208、Ser221、Ser223、Thr32、Thr50、Thr80、Thr129、Thr186、Thr210和Tyr107。本研究将SLA-DRA、SLA-DRB基因定向克隆到原核表达载体pET32a（+）中,构建了重组融合表达质粒子pET32a-DRA、pET32a-DRB,转化E.coli BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件,并初步纯化重组融合蛋白,结果表明:SLA-DRA、SLA-DRB基因在重组融合表达质粒pET32a（+）中的插入方向和读码框均正确;SLA-DRA、SLA-DRB基因已在E.coli BL21（DE3）中实现了融合表达,其表达量分别占菌体总蛋白的19.88%、17.26%,对表达条件进行了优化,其表达量分别达26.22%、21.98%:诱导2h后pET32a-DRA融合蛋白的表达量达到峰值,诱导3h后pET32a-DRB融合蛋白的表达量达到峰值。通过固定相粒子亲和色谱（IMAC）方法纯化重组融合蛋白,其中咪唑浓度为300mmol/L的Elution buffer的纯化效果都较好,纯化后的重组融合蛋白特异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.文献综述
• 1.1 MHC概况
• 1.1.1 MHC概念
• 1.1.2 MHC的分类
• 1.1.3 MHC的结构
• 1.1.4 猪主要组织相容性复合物（SLA）Ⅱ类基因的研究进展
• 1.2 MHC抗病性的研究进展及其应用
• 1.2.1 HLA与疾病的相关性
• 1.2.2 MHC与疾病易感性
• 1.2.3 基因座水平的疾病相关性研究
• 1.2.4 单体型水平的疾病相关性研究
• 1.3 猪抗病育种研究现状
• 1.3.1 机体抗病性的免疫遗传基础
• 1.3.2 猪疾病抗性的遗传水平上的研究
• 1.3.3 猪抗病育种的途径
• 1.3.4 展望
• 1.4 本研究的目的、意义和内容
• 2.材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验材料的采集
• 2.1.2 载体与菌株
• 2.1.3 生物信息学网络资源及应用软件
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 试验溶液的配制
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 RNA的提取
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 RT-PCR
• 2.2.4 SLA-DRA、SLA-DRB基因cDNA的克隆
• 2.2.5 测序与序列分析
• 2.2.6 生物信息学分析
• 2.2.7 原核重组表达质粒的构建
• 2.2.8 SLA-DRA和SLA-DRB在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物分析
• 2.2.9 重组融合蛋白的纯化
• 3.结果与分析
• 3.1 长白猪肠系淋巴结组织总RNA的提取
• 3.2 RT-PCR扩增SLA-DRA、SLA-DRB
• 3.3 重组克隆质粒的构建和鉴定
• 3.4 测序与序列分析
• 3.5 生物信息学分析
• 3.5.1 SLA-DRA、SLA-DRB的糖基化位点预测
• 3.5.2 SLA-DRA、SLA-DRB的磷酸化位点预测
• 3.5.3 SLA-DRA、SLA-DRB的疏水性预测
• 3.5.4 SLA-DRA、SLA-DRB的二级结构预测
• 3.6 原核重组表达质粒的构建和鉴定
• 3.7 SLA-DRA、SLA-DRB在大肠杆菌中的诱导表达及产物分析
• 3.7.1 SLA-DRA、SLA-DRB的诱导表达
• 3.7.2 SLA-DRA、SLA-DRB诱导表达条件的优化
• 3.7.3 表达产物的可溶性分析
• 3.8 重组融合蛋白的纯化
• 4.讨论
• 4.1 肠系淋巴结组织总RNA的提取
• 4.2 克隆片段的设计
• 4.3 克隆载体的选择
• 4.4 SLA-DRA、SLA-DRB基因的序列分析
• 4.5 SLA-DRA、SLA-DRB生物信息学预测
• 4.6 表达宿主菌的选择
• 4.7 载体载体的选择
• 4.8 SLA-DRA、SLA-DRB在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物分析
• 4.9 关于融合蛋白的可溶性分析
• 4.10 重组融合蛋白的纯化
• 5.结论
• 6.参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文
• 作者简介