大鼠肝癌变进程中差异表达序列标签的初步筛选及分析

论文摘要

目的:采用mRNA差异显示反转录聚合酶链式反应技术（DDRT-PCR）筛选大鼠肝癌变不同时期的差异表达序列标签（Express sequence tags, ESTs）,探索肝癌发生和发展的分子机理。方法:用二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine, DENA）作诱癌剂建立SD大鼠肝癌变不同时期的动物模型。自给药起,分别在14d、28d、56d、77d、105d、112d处死大鼠,取其肝组织,用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）研究不同病理时期差异表达的基因,克隆与测序后用生物信息学方法对测序结果进行分析。结果:获得12条差异表达片段。其中有3个片段（EST-1,EST-3,EST-5）在大鼠ESTs数据库和基因组数据库中均未找到同源序列,可能是新基因片段;有1个差异表达片段EST-12在大鼠ESTs数据库中未找到同源序列,但与基因组数据库中的蛋白激酶C- alpha基因有95%的同源性,可以认为是该基因的同源序列,可作为大鼠新的EST;有2个差异表达片段EST-7和EST-11分别与大鼠BN/SsNHsdMCW线粒体基因片段和酪氨酸/色氨酸单加氧酶激酶基因片段同源性达100%,可以认为分别是上述二种基因的部分序列,但BN/SsNHsdMCW线粒体基因编码蛋白尚未知晓;其余6个差异表达片段（EST-2、EST、EST-6、EST-8、EST-9和EST-10）在大鼠已知ESTs数据库和基因组数据库中的均找到与其同源达97%以上的序列,可以认为是已知基因的同源序列。结论:初步筛选出12个肝癌变进程中差异表达的ESTs,其中9个为已知基因片段, 3个为新基因片段。EST-7与大鼠线粒体BN/SsNHsdMCW基因片段同源性达100%,可以认为是该基因的一段序列。本研究首次发现线粒体BN/SsNHsdMCW基因在大鼠肝癌变各时期的差异表达情况。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 肝癌概述
• 1.2 肝癌的病因学
• 1.2.1 环境因素
• 1.2.2 内在因素
• 1.3 肝癌动物模型研究
• 1.3.1 动物模型概述
• 1.3.2 诱发性大鼠肝癌模型
• 1.4 MRNA 差异显示技术及在肿瘤研究中的应用
• 1.4.1 m RNA 差异显示技术的基本原理
• 1.4.2 m RNA 差异显示技术的优缺点
• 1.4.3 m RNA 差异显示技术的改进
• 1.4.4 m RNA 差异显示技术在肿瘤研究中的应用
• 1.5 肝癌相关基因的研究
• 1.5.1 肝癌相关癌基因
• 1.5.2 肝癌相关抑癌基因
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 大鼠肝癌模型的建立
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 一般试剂的配制
• 2.1.4 引物序列
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 组织病理切片制作与观察
• 2.2.2 总RNA 的提取及纯化
• 2.2.3 逆转录单链cDNA 的合成
• 2.2.4 PCR 扩增
• 2.2.5 差异表达片段的分离与回收
• 2.2.6 差异表达片段的二次PCR 及回收
• 2.2.7 PCR 产物的克隆及检测
• 2.2.8 DNA 片段的测序及核苷酸序列的分析
• 第三章 结果
• 3.1 肝癌病理结果
• 3.1.1 大鼠体征观察结果
• 3.1.2 大鼠肝脏肉眼观察结果
• 3.1.3 病理切片显微观察结果
• 3.2 肝组织总RNA 的提取与纯化结果
• 3.3 CDNA 鉴定结果
• 3.4 MRNA 差异显示结果
• 3.5 差异表达片段二次扩增结果
• 3.6 差异表达片段的克隆转化结果
• 3.7 阳性转化子的鉴定结果
• 3.8 差异表达片段的测序及同源性分析结果
• 3.8.1 测序结果（部分测序图谱见图22）
• 3.8.2 序列同源性分析结果
• 第四章 讨论
• 4.1 大鼠肝癌模型的建立
• 4.2 大鼠肝癌变进程中差异表达序列标签的初步分析
• 4.2.1 对已知ESTs 的分析
• 4.2.2 对未知ESTs 的分析
• 4.2.3 对未知基因的展望
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 图版
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录