论文摘要
牙周炎是严重危害人类口腔健康的感染性疾病,以牙菌斑为始动因子,结合遗传、环境、宿主免疫等因素共同致病。吸烟是牙周炎的重要危险因素之一,相比于不吸烟者,吸烟者牙周炎患病率、失牙率高且症状重、进展快、预后不良,对治疗反应性差。尼古丁作为烟草的重要毒性成分,可对牙周组织、细胞产生直接和间接的毒害作用,但具体机制不清。现有研究结果表明,尼古丁可能通过烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor,nAChR）通路,对牙周组织造成损害。随着非神经胆碱能系统（Non-neuronal Acetylcholine System,NNAS）的发现,越来越多的乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor,AChR）亚型表现出同神经系统不同的更加广泛的生理病理作用,如抗炎促炎作用、促凋亡及促进肿瘤转移等,为AChR功能的研究提供了新的视野。AChR包括烟碱型和毒蕈碱型受体,尼古丁为nAChR的特异性激动剂,它通过与细胞膜上的nAChR结合,开放离子通道,增加钙离子内流,从而引起细胞的生理病理反应;并且通过激活受体下游通路,如MAPK、ERK,最终激活NF-κB,导致细胞核变化,从而引起基因表达改变。研究表明,在nAChR中,乙酰胆碱受体α7亚型（α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR）主要介导了尼古丁对组织细胞的作用。目前,在非神经组织的上皮细胞、成纤维细胞、视网膜细胞中均发现α7nAChR的表达,并且在吸烟相关疾病,如炎症、肿瘤等疾病的发生发展中发挥重要作用。课题组前期研究证实在人牙胚细胞（human dental germ cells）、人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）中存在α7nAChR表达,并对其在大鼠牙周组织中的表达进行定位;同时在人牙周膜细胞内发现了完整的非神经胆碱能系统,包括乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）、胆碱乙酰转移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）、乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,AChE）、烟碱型和毒蕈碱型nAChR。还发现,α7nAChR激动剂尼古丁可上调大鼠牙周组织hPDLCs中α7nAChR表达,应用α7nAChR特异性拮抗剂α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin,α-BTX）可拮抗此上调作用。研究同时发现,hPDLCs表达的促炎细胞因子白细胞介素1β（interleukin,IL-1β）与α7nAChR的表达呈一致性,并且尼古丁引起IL-1β的改变也能被α-BTX拮抗。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）是一组重要的酶类,可降解细胞外基质胶原,而胶原纤维正是维系牙齿与牙槽骨连接牙周膜的主要成分。临床实验表明,牙周炎患者多种MMPs表达均有升高,有效的治疗可使其表达下降;体外实验也得出相似结论。研究显示尼古丁可通过α7nAChR刺激人视网膜细胞（retinal cell）表达MMPs,从而调控其血管生成作用。但尼古丁能否影响hPDLCs表达MMPs,机制如何,尚不清楚。本研究以体外培养人牙周膜细胞为实验模型,采用RT-PCR和ELISA等实验手段,在mRNA及蛋白水平检测尼古丁对hPDLCs MMPs表达的影响及可能机制,为探讨吸烟相关牙周炎病理机制提供理论依据。实验一人牙周膜细胞原代培养、传代及鉴定1主要方法取12-16岁青少年因正畸需要拔除的健康无龋前磨牙,无菌条件下冲洗、刮取牙根中1/3牙周膜组织,采用组织块法进行hPDLCs原代培养。在组织块周缘细胞爬出并增殖后,常规传代,并对细胞进行免疫组化染色,观察其波形丝蛋白,角蛋白表达情况,鉴定细胞来源。2主要结果组织块培养约一周后,其边缘陆续有成纤维样细胞爬出,常规传代后,倒置显微镜下见长梭形细胞,轮廓清晰,为纺锤形、星形,少见多角形;胞浆丰满、胞核清晰呈椭圆形,核仁明显且多见分裂相;细胞铺满培养瓶底,排列成漩涡或放射状。免疫组化染色显示,所培养细胞抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。3主要结论于体外成功地进行hPDLCs原代培养,建立了实验模型;所培养细胞抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,证实其来源于间充质。实验二RT-PCR及ELISA检测尼古丁对人牙周膜细胞MMP-1、3表达的影响1主要方法取生长良好第5代hPDLCs计数后接种于2个25mL培养瓶,贴壁24h后,分别加入含和不含尼古丁（10-4M）的5%新生牛血清的低糖DMEM培养基。作用24h后,将培养上清用于ELISA检测,并提取细胞RNA,反转录cDNA用于RT-PCR实验,比较两组MMP-1、3 mRNA和蛋白表达情况。2主要结果琼脂糖凝胶电泳结果显示:在203bp、716bp和667bp处分别出现β-actin和MMP-1、3单一条带,且尼古丁组表达高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;α-BTX组和α-BTX+尼古丁组表达相似,与对照组相比,无统计学意义（P>0.05）。ELISA实验中,依据各孔OD值换算实际浓度,尼古丁组均显著高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;α-BTX组和α-BTX+尼古丁组表达相似,与对照组相比,无统计学意义（P>0.05）。3主要结论RT-PCR及ELISA结果显示,对照组hPDLCs MMP-1、3 mRNA和蛋白均有表达,但表达水平较弱。尼古丁作用后,MMP-1、3表达增强,说明尼古丁可能通过促进hPDLCs分泌MMP-1、3,对牙周组织产生影响。实验三RT-PCR及ELISA检测尼古丁和/或α-BTX对人牙周膜细胞MMP-1、3表达的影响1主要方法取生长良好第5代hPDLCs,计数后接种于四个25mL培养瓶中,分组如下:①尼古丁组（10-4M）;②α-BTX组（1.25×10-9M）:③α-BTX+尼古丁组;④对照组。作用24h后,提取细胞RNA,反转录cDNA,进行RT-PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳;吸取细胞上清离心后用于ELISA实验。2主要结果将RT-PCR实验结果应用软件进行统计分析,尼古丁组MMP-1、3表达显著上调,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）;α-BTX组和α-BTX+尼古丁组表达与对照组相似,无统计学意义（P>0.05）。ELISA实验中,根据各组OD值换算实际浓度,统计学分析结果表明尼古丁组表达最强,与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）;α-BTX组和α-BTX+尼古丁组表达相似,与对照组相比,无统计学意义（P>0.05）。3主要结论在mRNA及蛋白水平,对照组hPDLCs MMP-1、3表达较弱,尼古丁可以上调hPDLCs MMP-1、3表达,与实验二结果一致。加入α7nAChR特异性拮抗剂α-BTX后,显著拮抗尼古丁对MMP-1、3上调作用,提示尼古丁调控hPDLCs分泌MMP-1、3,可能由α7nAChR通路介导。