论文摘要
[目的]寻找小鼠脑组织中分别与MCMV嗜神经蛋白即刻早期蛋白M122和早期蛋白M112-113存在相互作用的宿主因子,为阐明M122和M112-113蛋白在MCMV感染导致神经系统异常的分子机制中的具体作用提供线索。[方法]1.诱饵质粒的构建：采用RT-PCR的方法扩增MCMV的M122和M112-113基因片段,将其分别插入至载体pMD18-T simple载体,构建重组质粒pMD18-T-M122和pMD18-T-M112-113,用限制性内切酶EcoRI和SalI将重组质粒酶切鉴定,并测序；将测序正确的pMD18-T-M122和pMD18-T-M112-113重组质粒与空载体pGBKT7-BD分别用限制性内切酶EcoRI和SalI进行双酶切,凝胶回收M122和M112-113基因片段及pGBKT7-BD载体片段；将回收的M122和M112-113基因片段分别与pGBKT7-BD载体片段,用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,构建诱饵质粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113,并对其进行酶切鉴定和测序；2.诱饵质粒自激活作用和毒性作用检测：将测序正确的诱饵质粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113分别用小规模醋酸锂法转化AH109酵母感受态细胞,转化菌液涂布于色氨酸缺陷培养基（SD/-Trp）平板和铺有X-α-Gal的SD/-Trp （SD/-Trp/X-α-Gal）平板,30℃培养3-5d后观察平板上菌落的颜色、数量及大小；3.融合蛋白表达的验证：采用Western bloting方法验证诱饵蛋白pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113在酵母细胞中的表达；4.酵母双杂交筛选：将含有诱饵质粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113的AH109菌株分别与含有小鼠脑cDNA文库的Y187菌株进行配合,涂板于色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤营养缺陷培养基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）或色氨酸、亮氨酸和组氨酸营养缺陷培养基（SD/-Trp/-Leu/-His）进行筛选；5.阳性克隆质粒的分离及生物信息学分析：将筛选到的阳性克隆重复三次重新划线于铺有X-α-Gal的色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷培养基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal）,以分离得到真正含有相互作用蛋白的酵母菌；挑取单个的蓝色阳性克隆提取酵母质粒,转化大肠杆菌扩增,再次提取质粒并测序,测序结果与NCBI数据库进行序列比对和分析；6.回返验证及文库自激活作用的检测：将获得的阳性文库质粒与诱饵质粒一对一转化AH109酵母菌株,重新验证其在酵母中的相互作用,阳性文库质粒与空载体pGBKT7-BD亦采用同样方法被同时转入AH109感受态细胞,以排除阳性文库质粒的自激活作用；7.相互作用蛋白在哺乳动物细胞内相互作用的验证：采用化学发光免疫共沉淀技术验证M122蛋白与Stx8、Atplb3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4间的相互作用；8.M122相互作用位点的定位：构建7种表达不同长度M122片段的诱饵质粒,分别与pGADT7-Stx8、pGADT7-Atp1b3、pGADT7-Kcnab1、pGADT7-Ankrd17和pGADT7-Myst4共同转化酵母AH109细胞,通过营养缺陷筛选确定M122与Stx8、Atp1b3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4相互作用的作用位点。[结果]1.成功构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113,经酶切鉴定及测序证实,插入片段大小正确,序列比对显示与MCMV M122和M112-113基因的核苷酸序列一致；2.诱饵质粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113成功转入酵母细胞AH109中,两者均无自激活作用,且对酵母细胞无毒性作用；3.诱饵质粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113能够在酵母细胞AH109中稳定表达蛋白；4.筛选出与M122相互作用蛋白分子24种,其中,21种为已知基因编码蛋白和3种为未知基因编码蛋白；而与M112-113蛋白存在相互作用的蛋白分子有3种；5.回返验证实验进一步证实这些蛋白与M122或M112-113蛋白能够在酵母细胞AH109发生相互作用；但以M122为诱饵筛选出的蛋白分子Aplg1和Cul1和以M112-113为诱饵筛选出的蛋白分子Pias2被证实具有自激活作用；6.化学发光法免疫共沉淀技术证实M122与Stx8、Atp1b3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4存在相互作用；7.M122与Stx8、Atp1b3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4相互作用的作用位点的分析显示,M122 N末端1-148个氨基酸是产生相互作用的重要区域。[结论]1.成功构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒pGBKT7-M122和pGBKT7-M112-113,且证实两者均不具有自激活作用,对酵母菌株AH109亦无毒性,能够用于筛选宿主细胞中与MCMV嗜神经蛋白M122或M112-113存在相互作用的蛋白分子；2.筛选出MCMV即刻早期蛋白M122和早期蛋白M112-113在脑组织中的互作分子,为阐明M122和M112-113蛋白在MCMV感染导致神经系统异常的分子机制中的具体作用提供了线索；3.证实MCMV即刻早期蛋白M122和Stx8、Atp1b3、Kcnab1、Ankrd17和Myst4存在相互作用,明确了M122的作用位点,为深入研究M122蛋白在MCMV致神经系统损伤的分子致病机制中的作用奠定了实验基础。
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