论文摘要
囊泡型H+-ATPase （V-ATPase）是一个高度保守的、多亚基膜结合复合酶体,由至少14个不同的亚基组成了具有活性的全酶,广泛地分布在原核和真核细胞中。V-ATPase作为多种细胞内膜系统中一个ATP驱动的质子泵,通过控制细胞酸性环境来调控细胞的各种生理过程。这种酸性环境对许多重要的细胞过程特别是某些细胞器途径是必不可少的。在真核细胞中,微丝、微管和中间纤维共同构成了内在的高度动态的细胞骨架,以适应细胞形态发育的需要,维持大多数细胞生命活动,其中微丝骨架为细胞提供了内在的机械支持。许多细胞生理活动都与微丝骨架的动态变化密切相关。在开花植物的有性生殖过程中,花粉萌发和花粉管生长是两个关键的逐步形成的重要的环节,其中微丝骨架起着决定性的作用。在花粉的不同萌发时期和小同部位,微丝骨架都呈现出一种精密调控和高度动态的结构,与此同时微丝骨架的这种动态变化又受许多微丝结合蛋白的调控。研究表明,在真核细胞中V-ATPase B亚基通过其N-末端上的微丝结合位点直接和微丝骨架相互作用,参与到微丝骨架动态装配以及花粉萌发和花粉管生长的生理过程中,并发挥着重要的作用。本研究主要从体内体外对拟南芥（Arabidopsis thaliana） V-ATPase B1、B2和B3亚基参与细胞微丝骨架动态装配的生理生化功能以及V-ATPase参与调控拟南芥生长发育信号转导的作用进行了研究,结果表明：1、通过对拟南芥V-ATPase B1、B2和B3基因（AtVHA-B1、-B2和-B3）和蛋白（AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3）的生物信息学预测分析,发现AtVHA-B1基因和AtVHA-B3基因定位于拟南芥1号染色体,但二者在染色体上的距离较远,AtVHA-B2基因定位于拟南芥4号染色体；在AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3上具有两个潜在的肌动蛋白结合位点：profilin-like结构域和]LKXXET-like结构域；AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3之间的序列一致性达到97.27%,但三者却存在一个非保守区。这充分表明,AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3在细胞微丝骨架的动态装配与植物细胞发生发育与信号转导中发挥着关键的作用,可能参与拟南芥花粉萌发、花粉管生长、细胞内物质流动以及细胞应急胁迫、质子传递等生殖生物学过程,并发挥各自不同但又相互协调的功能角色。2、通过对AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3的表达模式和体外参与微丝动态装配的生化功能比较研究,揭示了AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3具有基本相似的表达模式,且均具有微丝结合、成束、封端和剪切活性；同时三者又存在明显的差异,即AtVAB1促进微丝的解聚,同时具有较强的封端活性和剪切活性,并抑制了微丝的延伸;AtVAB2则抑制微丝的解聚,稳定微丝,并具有浓度依赖性的封端活性,其剪切活性较AtVAB1低；而AtVAB3则具有较精细的调控作用,可能在AtVAB1和AtVAB2均功能性补偿中发挥一定的作用。而且,Ca2+也以不同的调控方式参与到AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3各自的活性调控过程中。3、通过对AtVAB2在不同的pH环境和Ca2+环境中,对微丝动态装配的调控作用的研究,阐明了AtVAB2乍为一个微丝结合、束化、封端和剪切蛋白,参与细胞微丝骨架的动态装配,并受pH条件的显著调控。同时Ca2+由于不同的pH条件也参与到AtVAB2的这种调控过程中。4、通过对AtVAB2在体内参与花粉萌发和花粉管生长以及稳定花粉粒和花粉管中微丝骨架结构作用的研究,发现在AtVAB2功能缺失后,花粉萌发和花粉管生长对微丝解物LatB更敏感；同时,在花粉粒和花粉管中,微丝骨架结构形态也因AtVAB2功能缺失变得更加不稳定,花粉萌发率降低,花粉管生长受到显著抑制。这揭示了AtVAB2通过稳定细胞中微丝骨架的结构参与到花粉萌发和花粉管生长乃至细胞发育和细胞周期中来,从而发挥重要的作用。进一步分析揭示ATVAB2这种生理功能有可能通过两个途径实现：一方面,其作为一个微丝结合蛋白,参与调控微丝骨架动态装配,从而影响花粉的生长发育；另一方面,其作为V-ATPase一个重要的亚基,通过调控V-ATPase的组装／解离来调节V-ATPase的活性,从而影响细胞腔内的酸化状态,进而影响花粉的生长发育。进一步揭示了在细胞内AtVAB2与V-ATPase可能发挥着各自独立的功能角色。5、通过对V-ATPase参与调控许多细胞内信号途径研究,阐释了V-ATPase作为一种高度动态的多亚基复合酶体,其受活性各种因子的调控。揭示拟南芥V-ATPase可能介导了花粉萌发和花粉管生长乃至拟南芥生长发育的细胞信号转导过程。综上所述,本研究通过探究V-ATPase B亚基在细胞微丝骨架动态装配中的作用机理,阐明了V-ATPase B亚基参与细胞微丝骨架动态装配的调控机制,揭示了V-ATPase及其B亚基参与植物生理过程的分子机理,具有重要的科学理论价值。另外,AtVAB1、AtVAB2和AtVAB3功能的差异研究揭示三者可能参与了同一细胞事件的不同生理过程或者不同细胞过程的不同调控途径,从而使其在拟南芥生命历程的漫长进化过程中被保守地遗传下来,这为拟南芥分子遗传学和发育生物学研究提供了重要的理论依据。
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