论文摘要
目的:应用分子生物学及免疫组化方法,研究皮瓣组织缺血再灌注（ischemia-reperfusion I/R）损伤不同时间点相关凋亡基因p53表达的变化规律,探讨缺血再灌注损伤对皮瓣组织细胞凋亡及相关基因p53表达的影响,从基因水平,为临床上减轻直至消除皮瓣组织缺血再灌注损伤、提高皮瓣移植成活率,从调控细胞凋亡角度开辟新的治疗途径。方法:1实验动物:健康Wister大鼠40只,称重,编号。2实验动物分组:将大鼠随机分为2组,即对照组（非缺血再灌注组）和实验组（缺血再灌注组）,每组20只,每组分为5个时间点取材,每个时间点4只。3皮瓣制备方法:2%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉,每3小时追加一次（20mg/kg）以维持麻醉,大鼠仰卧,四肢固定,剪除腹毛,75%酒精消毒,按照Petry JJ等描述的方法,于右下腹设计一以腹壁浅血管为蒂的轴形皮瓣,大小为6cm×3cm。对照组即非IR组:按上述方法制备皮瓣,皮瓣形成后原位缝合,不做其他处理;实验组即IR组:按上述方法制备皮瓣,皮瓣形成后,用微血管夹夹闭腹壁浅动脉发出点近端的股动脉,8小时后手术去除血管夹。4取材:对照组的20只大鼠于掀起皮瓣即刻、9h、14h、20h、32h分别于皮瓣中段边缘取全层皮瓣组织1cm×0.5cm,实验组的20只大鼠于术后即刻、1h、6h、12h、24 h同法取材。将所取组织一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,及时制成石蜡切片,待做HE染色、免疫组化染色;将另一部分组织（约100mg）于液氮箱保存,备p53 mRNA检测。5检测方法及指标:（1）将石蜡切片进行HE染色,观察组织结构改变。（2）免疫组化检测及评分:对石蜡切片进行SP法免疫组化染色,染色步骤遵照试剂盒说明书进行,光镜下观察p53蛋白的分布和着色深浅程度,阳性与阴性对照同时进行,阳性信号以胞浆或胞膜有棕黄色或棕褐色颗粒为判断。免疫组化评分（immunohistochemical scores IHS）方法参照文献,结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分:a为阳性细胞百分比（无阳性细胞= 0,阳性细胞占1-10% = 1,11-50% = 2,51-80% = 3,81-100% = 4）,b为阳性细胞染色强弱（阴性= 0,弱阳性= 1,中度阳性= 2,强阳性= 3）,a,b两项乘积即为该例组织的IHS。（3）逆转录-多聚酶链反应法（reverse transcription,RT-PCR）半定量检测p53 mRNA水平:依据文献报道设计引物。引物序列:p53上游引物:5’- CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC -3’,p53下游引物5’-CTGTGCCGAAAAGTCTGCCTGTCGTC -3’。β-actin上游引5’-TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG -3’,β-actin下游引物: 5’- GGAACCGCTCATTGCCGATAGT -3’。按Trizol RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA,RNA保存在液氮中,电泳后于紫外透射仪观察,数码相机照相后输入微机,应用凝胶图象分析系统对目的电泳条带进行分析,以相应的内参电泳条带作为参照,结果以两者之积分吸光度的比值表示。6统计学处理:用SPSS13.0统计学处理软件,对不同类型数据进行不同的统计学处理。结果:1 HE染色组织学检查:非-IR组各时段皮下组织水肿轻,组织内炎性细胞浸润少见,细胞排列整齐。IR组术后1h,组织出现充血、水肿,表皮角质层开始出现局部破损,血管扩张,可见散在的局灶性中性粒细胞浸润,6h皮下组织水肿严重,皮肤各层结构疏松、紊乱,在血管周围可见大量中性粒细胞粘附、聚集,有大量白细胞、红细胞渗出到组织间隙; 24h原有情况继续加重,中性粒细胞进一步增多,血管的完整性破坏,皮肤坏死程度较重,结构不清。（图14）。2实验组术后即刻,再灌注1h、6h、12h、24h中p53相对表达量分别为（表5）:（0.132±0.011）、（0.262±0.0528）、（0.371±0.057）、（0.467±0.068）和（0.552±0.047）。实验组在皮瓣缺血再灌注损伤后,p53mRNA的变化随着缺血再灌注时间的延长,该基因转录表达水平逐渐增高,至再灌注后24小时达到高峰,且实验组明显高于对照组（P < 0.05）。3免疫组化结果:光镜下观察,p53阳性细胞染色呈棕黄色或棕褐色。非IR组和IR组术后即刻,偶见p53蛋白表达在血管壁细胞,IR组术后9 h和33 h见上皮基底层细胞、皮下组织成纤维细胞、血管壁细胞、毛囊少量阳性细胞表达。IR组再灌注1 h上皮基底层细胞、皮下组织成纤维细胞、血管壁细胞、毛囊、皮脂腺和汗腺均有阳性表达,再灌注6h、12h、24 h p53蛋白表达部位与再灌注1h相同,但阳性细胞数呈上升趋势,阳性表达强度增加,（P < 0.05）。结论:皮瓣组织发生缺血再灌注损伤诱导时p53表达增加,这说明调亡相关基因p53参与缺血再灌注损伤机制,并为从基因角度调控皮瓣组织细胞凋亡提供理论依据。
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- [1].不同级别宫颈上皮内瘤变与人乳头状瘤病毒感染及p53蛋白表达的相关性[J]. 延边大学医学学报 2019(03)
- [2].云南汉族非综合征性唇腭裂与p53基因多态性的相关性研究[J]. 中国美容医学 2020(04)
- [3].p53突变与结肠癌的研究进展[J]. 岳阳职业技术学院学报 2020(02)
- [4].Ki-67、p53的表达水平在不同分子分型的乳腺浸润性导管癌中的临床意义[J]. 实用癌症杂志 2020(07)
- [5].头颈部鳞状细胞癌中与p53突变相关基因的鉴定[J]. 现代肿瘤医学 2020(17)
- [6].p53和Ki-67与子宫内膜癌患者临床病理特征的关系研究[J]. 当代医学 2020(21)
- [7].老年非小细胞肺癌化疗患者p53及VEGF水平与生存状况的相关性[J]. 中国老年学杂志 2020(15)
- [8].p53基因家族与甲状腺癌的相关研究进展[J]. 中国普外基础与临床杂志 2019(11)
- [9].检测p53蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义[J]. 中外医学研究 2019(31)
- [10].p53与消化系统恶性肿瘤的研究进展[J]. 实用肿瘤学杂志 2016(05)
- [11].胰岛素受体酪氨酸激酶底物p53蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及其对患者预后的影响[J]. 肿瘤防治研究 2017(04)
- [12].子宫内膜癌中P53、Ki-67和CA125的表达[J]. 肿瘤基础与临床 2017(01)
- [13].P53和Ki-67在喉鳞状细胞癌中的表达及与短期预后的关系[J]. 临床与病理杂志 2017(03)
- [14].p53在胶质瘤中的研究进展[J]. 海南医学 2017(08)
- [15].p53免疫组化判定肾母细胞瘤预后的研究[J]. 临床小儿外科杂志 2016(02)
- [16].抑癌基因p53、PTEN与子宫内膜癌预后相关性分析[J]. 河南科技大学学报(医学版) 2017(02)
- [17].Bcl-2,Cox-2,HSPs和p53在骨肉瘤患者中的表达及临床意义[J]. 临床与病理杂志 2017(06)
- [18].VEGF、P53的表达与食管癌临床特征及预后的关系[J]. 河北医药 2017(12)
- [19].P53在肿瘤微环境、细胞代谢中的调控机制及检测技术的研究进展[J]. 临床检验杂志 2017(08)
- [20].p53和鼠双微粒体2在肾母细胞瘤中的表达[J]. 中华实用诊断与治疗杂志 2016(02)
- [21].黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织P53及Ki-67蛋白表达的影响[J]. 中国生化药物杂志 2016(03)
- [22].p53和Ki-67表达在乳腺癌中的临床意义[J]. 国际检验医学杂志 2016(05)
- [23].乳腺浸润性导管癌X线征象与Ki-67、p53表达的关系及临床意义[J]. 解放军医学院学报 2016(04)
- [24].P53蛋白表达与晚期卵巢浆液性腺癌预后的相关性[J]. 中国医学科学院学报 2016(02)
- [25].p53与胃肠道恶性肿瘤相关性的研究进展[J]. 中国中西医结合消化杂志 2016(04)
- [26].胸腺瘤组织中P53、Ki-67、VEGF表达的相关性[J]. 临床和实验医学杂志 2016(11)
- [27].p53蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及意义探究[J]. 中国实用医药 2016(18)
- [28].P53在结节性甲状腺肿合并甲状腺癌中的表达及其相关性研究[J]. 实用癌症杂志 2016(10)
- [29].PTEN和P53蛋白与子宫内膜癌发生发展的相关性研究[J]. 临床和实验医学杂志 2016(21)
- [30].COX-2、P53在胃癌组织中表达的意义[J]. 临床合理用药杂志 2014(34)