Calpain活化对跨膜AMPA受体调节蛋白的影响及其作用机制研究

论文摘要

第一部分体外calpain原位活化对大鼠脑组织stargazin/TARP-γ8的影响目的：在中枢神经系统,AMPA受体介导快速兴奋性突触传导,突触膜上AMPA受体的数量和功能直接影响突触传导的效能。TARPs作为跨膜AMPA受体调节蛋白家族,在AMPA受体由细胞内向细胞外转运、突触膜定位及调节受体功能方面起着重要的作用。Calpain是一种钙激活中性蛋白酶,活化后通过裂解AMPA受体亚单位来调节AMPA受体在突触后致密区的表达。本部分实验旨在通过原位活化calpain后,研究大鼠脑组织各部位跨膜AMPA受体调节蛋白家族（TARPs）的主要成员stargazin及TARP-γ8的表达情况,以明确calpain的活化是否会导致stargazin及TARP-γ8免疫活性的变化。方法：实验采用生后4周的SD雄性大鼠（n=4）,断头取脑后直接制作冰冻切片（20μm）,给予含有氯化钙或者calpain抑制剂的缓冲液进行预处理,采用免疫组织化学染色的方法,光镜下观察stargazin及TARP-γ8在各部分脑组织的表达情况。并且对不同预处理后的冰冻切片进行western blot蛋白印迹法检测,定量分析stargazin及TARP-γ8蛋白的表达情况。最后,为进一步论证实验结果,直接使用calpain活化脑细胞膜成分,使用western blot蛋白印迹法检测stargazin及TARP-γ8的表达情况。结果：冰冻切片的免疫组织化学结果显示,经氯化钙处理后,脑组织各区域包括小脑、海马CA1、海马CA3及大脑皮质层中,stargazin的免疫反应性明显下降,P<0.001。使用calpain抑制剂Ⅲ处理后,stargazin表达情况恢复到对照组水平,和氯化钙组相比,结果具有统计学意义,p<0.001。冰冻切片匀浆的western蛋白印迹结果显示,氯化钙处理后stargazin的蛋白表达量明显降低,量化结果显示,和对照组相比,stargazin下降的程度为80%左右,具有显著的统计学意义,p<0.001。经calpain抑制剂Ⅲ处理后,stargazin蛋白下降的效应被阻断,量化结果和对照组相仿,和氯化钙处理组相比,结果具有统计学意义,p<0.001。脑细胞膜成分的western蛋白印迹结果进一步证实了免疫组化的结果,stargazin在经活化的calpain处理后,表达明显下降,和对照组相比,存在显著差异,p<0.001。和stargazin的结果不同,冰冻切片的免疫组织化学结果显示,氯化钙处理后,TARP-γ8的免疫活性在海马各区的椎体细胞胞体层明显增加,树突部位的免疫活性没有发生变化,和对照组相比,胞体层蛋白表达水平的升高具有统计学差异,p<0.001。给予calpain抑制剂Ⅲ处理后,并没有改变TARP-γ8在海马椎体细胞胞体层的免疫活性,表达情况和对照组相仿。在大鼠大脑皮层,不同处理组TARP-γ8的表达情况没有发生变化。冰冻切片匀浆的western blot蛋白印迹结果显示,各组TARP-y 8的表达没有发生改变。脑组织膜成分的western blot蛋白印迹结果显示,经活化的calpain直接处理后,TARP-γ8的免疫表达没有发生变化。结论：本研究的结果表明1.stargazin作为calpain的作用底物,其羧基末端被原位活化的calpain所裂解。2.TARP-γ8并不是calpain的作用底物,但是它在海马组织的表达和分布和钙相关,提示存在另一种钙依赖的介导物质。3. calpain介导的stargazin羧基末端裂解是一种通过calpain活化来调控突触后致密区AMPA受体数目和功能的机制。第二部分：Calpain活化介导的stargzain羧基端裂解在红藻氨酸诱导惊厥中的作用目的：作为兴奋性神经递质谷氨酸盐的离子型受体,AMPA受体介导中枢神经系统兴奋毒性反应的病理生理过程。红藻氨酸诱导的惊厥发作是研究癫痫和神经兴奋毒性损伤的经典模型,同时红藻氨酸也是体内活化calpain的方法之一。本部分实验主要研究红藻氨酸诱导大鼠惊厥过程中,calpain体内活化所介导的stargazin及TARP-γ8在大鼠脑组织各部分的表达变化情况,从而揭示calpain活化所介导的TARPs变化在惊厥及神经元兴奋毒性损伤中的作用及可能的潜在机制。方法：实验采用4周龄SD雄性大鼠（n=16）,随机分成红藻氨酸诱导惊厥2小时组、红藻氨酸诱导惊厥4小时组及相关对照组。惊厥组给予腹腔注射红藻氨酸（10mg/Kg）。根据Racine分级判断惊厥级别,惊厥发作达到第5阶段或以上者纳入实验。惊厥组分别在惊厥发作2小时后及4小时后灌注取脑,通过免疫荧光检测stargazin及TARP-γ8在大鼠脑组织各部位的分布及表达情况、stargazin及TARP-γ8和AMPA受体GluRl亚单位同时表达情况。另外,为进一步证明免疫组织化学的结果,分别在惊厥发作2小时和4小时后获取大鼠小脑、海马和大脑皮层部位的组织,通过western blot蛋白印迹法定量检测stargazin在脑组织不同部位的表达情况。结果：免疫荧光的结果显示,红藻氨酸诱导惊厥发作后2小时以及4小时,在小脑浦肯野纤维细胞、海马CA1、CA3、齿状回以及大脑的梨状皮层中,stargazin的表达明显下降。量化结果显示,和对照组相比,差异具有统计学意义,p<0.01。惊厥不同时间组之间比较,stargazin的表达没有发生变化。另外,在海马及大脑皮层,stargazin和AMPA受体的GluRl亚单位同时表达,在红藻氨酸诱导惊厥后,脑组织各部位的GluRl表达水平明显下降,下降程度和stargazin相仿,和对照组相比,差异存在统计学意义,p<0.01。Western blot蛋白印迹检测的结果和免疫荧光结果一致。和体外实验不同的是,红藻氨酸诱导惊厥后,TARP-γ8在海马部位的表达水平降低,和对照组相比存在统计学差异,p<0.01。TARP-γ8在大鼠大脑皮层的表达水平没有发生变化,和体外结果一致。结论：1.体内红藻氨酸诱导的calpain活化导致stargazin羧基末端裂解。2.虽然TARP-γ8不是calpain的作用底物,但是在惊厥过程中TARP-γ8在海马的表达和分布呈现一个钙依赖的过程,提示可能存在另一种钙依赖物质介导TARP-γ8的降解。3.在惊厥发生过程中,calpain活化介导的stargazin降解可能是一种减少神经兴奋毒性损伤的反馈性保护机制。4. calpain介导的stargazin羧基末端裂解可能是一种通过calpain活化来调节AMPA受体药理学性质的机制,为癫痫治疗学提供新的研究方向。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分:体外calpain原位活化对大鼠脑组织stargazin/TARP-γ8的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分:Calpain活化介导stargazin羧基端裂解及其在红藻氨酸诱导惊厥中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述:AMPA受体跨膜调节蛋白的研究进展
• 参考文献
• 发表论文1
• 发表论文2
• 致谢