论文摘要
第一部分小鼠异位小肠移植模型的建立目的：建立稳定的小鼠异位小肠移植模型。方法：采用小肠供体的门静脉（Portal vein, PV）与受体下腔静脉（Inferior vena cava, IVC）端侧吻合,供体带主动脉片的肠系膜上动脉（Superior mesenteric artery, SMA）与受体腹主动脉端侧吻合,供体近端肠管结扎,远端与受体空肠端侧吻合的方式建立异位小肠移植模型。选用C57BL/6小鼠做供体和BALB/c小鼠作受体进行同种异基因型异位节段性小肠移植（Small bowel transplantation, SBT）。术后禁食3天,不禁饮,每天分两次经皮下分别给予5%葡萄糖生理盐水2m1,术后不使用抗生素和免疫抑制剂。小鼠存活超过5天认为手术成功。结果：建模初期共完成50例,仅有9例完成了手术全过程,其余41例均在手术过程中死亡,死亡原因为动脉吻合口血栓形成20例,大出血致出血性休克8例,门静脉吻合口血栓形成5例,吻合后血管狭窄3例,麻醉意外3例,术后腹腔内感染1只,原因不明1例。建模成熟稳定期共完成60例定型手术,供体手术时间37.18±5.40min,热缺血时间约0.5min,供体肠段肠系膜上动脉组织片修整时间为3.58±0.52min,供体冷保存时间为29.76±3.22min,受体手术时间80.28±2.25min,其中腹主动脉及下腔静脉阻断时间为38.15±2.71min,静脉吻合时间11.03±0.67min,动脉吻合时间16.32±1.60min,成活小鼠受体手术平均出血量约0.2ml。术后24h存活率为80%（48/60）,术后5天生存率为70%（42/60）。手术失败的18只小鼠主要死亡原因为动脉吻合口血栓形成8例,动脉吻合口部位狭窄4例,吻合口出血导致出血性休克4只,术后腹腔内感染1只,原因不明1例。结论：1、采用改良方法建立的小鼠异位小肠移植模型稳定可靠,可为后继实验研究提供基础；2、小鼠小肠移植手术难度大,良好的供体肠段的获取、高质量的血管吻合及供、受体补液是提高小鼠小肠移植手术成功率的关键。第二部分小鼠小肠移植排斥反应的观察目的：探讨各种免疫细胞及细胞因子在小鼠小肠移植排斥反应中的作用及可能机制,寻找反映排斥反应的指标。方法：供体为C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠,受体为BALB/c小鼠,均为雄性,将实验动物随机分为4组,n=6：A组为BALB/c→BALB/c组,术后（Post operation day,POD）11天处死；B组为C57BL/6→BALB/c组,POD3处死；C组为C57BL/6→BALB/c组,POD7处死；D组为C57BL/6→BALB/c组,POD11处死。采用前述方式建立小鼠异位小肠移植模型,于术后相应天数获取标本。称取受体脾脏重量并分离脾脏细胞,ELISA法检测血清IL-10、IFN-γ和IL-17浓度水平,HE （Hematoxylin-Eosin）染色观察移植小肠病理变化,流式细胞技术检测受体小鼠脾脏及移植小肠内浸润细胞中各种细胞亚型。结果：移植小肠组织病理学检测发现,A组无排斥反应发生,B组为轻度排斥反应,C组为中度排斥反应,D组为重度排斥反应；血清中IL-10、IL-17水平在各组间均具有显著差异（P<0.05）,IL-10在A、B、C、D组中依次降低,而IL-17则相反,在A、B、C、D组中依次增高；血清中IFN-γ水平,A组与B组无显著差异（P>0.05）,B、C、D组间均有显著差异（P<0.05）,在B、C、D组中依次增高；脾脏重量及其细胞数,各组间均具有显著差异（P<0.05）,在A、B、C、D组中依次增高；脾脏中T细胞与B细胞比例,A组与B组均无显著差异（P>0.05）, B、C、D组间均具有显著差异（P<0.05）,在B、C、D组中均依次降低；脾脏中中性粒细胞比例在各组间均有显著差异（P<0.05）,在A、B、C、D组中依次增高；脾脏T细胞中CD4+T细胞比例,A组与B组、C组与D组均无显著差异（P>0.05）,C组较B组显著降低（P<0.05）；脾脏T细胞中CD8+T细胞比例,A组与B组、C组与D组均无显著差异（P>0.05）,C组较B组显著增高（P<0.05）；脾脏T细胞中CD4-CD8-T细胞比例, A组与B组无显著差异（P>0.05）, B、C、D组间均具有显著差异（P<0.05）,在B、C、D组中依次增高；脾脏CD4+T细胞中Thl细胞比例和CD8+T细胞中Tcl细胞比例,A组与B组均无显著差异（P>0.05）, B、C、D组间均具有显著差异（P<0.05）,在B、C、D组中均依次增高；脾脏CD4+T细胞中Th2细胞与Th17细胞比例,各组间均具有显著差异（P<0.05）,Th2细胞在A、B、C、D组中依次降低；而Th17细胞则相反,在A、B、C、D组中依次增高；移植小肠浸润细胞中T细胞比例,A、B、C组间均具有显著差异（P<0.05）,在A、B、C组中依次降低,C组与D组无显著差异（P>0.05）；移植小肠浸润细胞中B细胞及中性粒细胞比例在各组间均具有显著差异（P<0.05）,B细胞在A、B、C、D组中依次降低,中性粒细胞则在A、B、C、D组中依次增高；移植小肠浸润T细胞中CD4+T细胞与CD8+T细胞比例在各组间均具有显著差异（P<0.05）, CD4+T细胞在A、B、C、D组中依次降低,CD8+T细胞则在A、B、C、D组中依次增高；移植小肠浸润T细胞中CD4-CD8-T细胞比例,在A、B、C、D组间均无显著差异（P>0.05）；移植小肠浸润CD4+T细胞中Th1、Th17细胞比例及浸润CD8+T细胞中Tcl细胞比例,各组间均具有显著差异（P<0.05）,在A、B、C、D组中均依次增高；移植小肠浸润CD4+T细胞中Th2细胞比例,A组与B组无显著差异（P>0.05）, B、C、D组间均具有显著差异（P<0.05）,在B、C、D组中依次降低。结论：1、小肠移植术后排斥反应是以T淋巴细胞介导的细胞免疫为中心的多种免疫细胞及细胞因子参与的复杂过程；2、Th1、Th17及Tcl细胞参与了移植后排斥反应,其细胞数量及相应细胞因子IFN-γ和IL-17浓度可作为反映排斥反应的指标；3、Th2细胞及其细胞因子IL-10具有免疫调节作用,可诱导免疫耐受。第三部分Toll样受体在小鼠小肠移植排斥反应和诱导免疫耐受中的作用及其机制的研究目的：研究Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）在小肠移植排斥反应中的作用及可能机制,探讨在小肠移植中通过阻断TLRs信号传导通路实现特异性免疫耐受的可能性及其可能机制。方法：供体为C57BL/6小鼠,受体为野生型或MyD88-/-BALB/c小鼠,均为雄性,将实验动物随机分为4组：A组为C57BL/6→BALB/c组,POD7处死；B组为C57BL/6→MyD88-/-BALB/c组,POD7处死；C组为C57BL/6→BALB/c组,POD1 1处死；D组为C57BL/6→MyD88-/-BALB/c组,POD11处死。采用前述方式建立小鼠异位小肠移植模型,于术后相应天数获取标本。各组分别重复7次实验后,其中1次取受体脾脏行免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色,6次行其余实验,实验结果取均值（n=6）。称取受体脾脏重量并分离脾脏细胞,ELISA法检测血清IL-10、IFN-γ和IL-17浓度水平,HE染色观察移植小肠病理变化,流式细胞技术检测受体小鼠脾脏及移植小肠内浸润细胞中各种细胞亚型,同时获取脾脏细胞行混合淋巴细胞培养（Mixed 1ymphocytes reaction,MLR）。结果：移植小肠组织病理学检测发现,A组发生中度排斥反应,B组为轻度排斥反应,C组为重度排斥反应,D组为轻-中度排斥反应；血清中IL-10水平,B组较A组、D组较C组均显著增高（P<0.05）;血清中IFN-γ与IL-17水平,B组较A组、D组较C组均显著降低（P<0.05）；受体脾脏重量及其细胞数,B组较A组、D组较C组均显著降低（P<0.05）；脾脏T细胞和移植小肠浸润T细胞中调节性T细胞（Regulatory T cell, Treg）比例,B组较A组、D组较C组均显著增高（P<0.05）；移植小肠浸润T细胞中CD4+T细胞比例,B组较A组、D组较C组均显著增高（P<0.05）；移植小肠浸润T细胞中CD8+T细胞比例,B组较A组、D组较C组均显著降低（P<0.05）；移植小肠浸润T细胞中CD4-CD8-T细胞比例,B组较A组、D组较C组均无显著差异（P>0.05）；脾脏和移植小肠浸润CD4+T细胞中Th1、Th17细胞比例及CD8+T细胞中Tcl细胞比例,B组较A组、D组较C组均显著降低（P<0.05）；脾脏和移植小肠浸润CD4+T细胞中Th2细胞比例,B组较A组、D组较C组均显著增高（P<0.05）；脾脏行Foxp3IHC染色计数Foxp3阳性细胞数目,B组较A组、D组较C组均显著增高（P<0.05）; MLR示刺激指数,B组较A组、D组较C组均显著降低（P<0.05）。结论：1. TLRs在小肠移植术后排斥反应的发生发展过程中具有重要作用,通过阻断TLRs信号传导通路可达到免疫耐受；2、CD4+Foxp3+Treg能够诱导和维持小肠移植后的免疫耐受,其机制可能与细胞因子IL-10相关；3、TLRs可能通过调控Treg而影响小肠移植后排斥反应的发生、发展,阻断TLRs信号传导通路可上调Treg细胞数量从而诱导免疫耐受。
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