AHLs信号分子抑制剂的分离提取

论文摘要

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的群体感应机制（quorum-sensing）是目前世界上的研究热点。有研究发现在PA01的生长过程中,除分泌信号分子外,还可随之分泌出一种信号分子抑制剂。该信号分子抑制剂对群体感应中的酰基高丝氨酸内酯（AHLs）类的信号分子有明显的抑制作用,并且它能够直接稳定的存在于发酵液中,对存放环境的要求较低,耐酸、耐碱、抗高温,非常适合应用于创伤、烧伤等病人在临床治疗中口服和抵抗由铜绿假单胞菌引起的各种急慢性感染。具有很好的研究前景和很高的潜在应用价值。而想要达到最后的应用目标,必须对它进行分离纯化以测定其结构,并对它的一些性质进行深入研究。本实验首先尝试利用醇溶、大孔吸附树脂、高效液相色谱和离子交换树脂对该抑制剂进行进一步的纯化。发现利用甲醇和乙醇对其进行溶解,都可以除去糖类和无机小分子等不溶于醇的物质,最后决定选用乙醇。在色谱方面,只有阴离子交换树脂对其具有保留作用,而大孔吸附树脂、高效液相色谱和阳离子交换树脂对其均没有保留作用。所以在后续实验中可以选择阴离子交换树脂对其进行进一步的提纯。通过对实验结果的分析我们认为,该抑制剂应为一种具有强极性的有机小分子,并且带有强极性的阴离子基团。其次我研究了碳源、氮源和通风量对PA01生产分子信号抑制剂的影响。通过实验发现碳源和氮源对该抑制剂的生产有极大的影响,在部分碳源和氮源中我们甚至测不到任何抑制剂活性;而装液量的影响则不大,随着装液量的增加抑制剂活力只有极小幅度的增加。我们通过这些实验还发现,该信号分子抑制剂的活力与菌体浓度之间应该存在着某些联系。另外,因为蛋白酶、果胶酶、几丁质酶和纤维素酶是寄生型微生物侵入宿主过程中的常见酶,所以本实验还对发酵液中是否存在着这四种酶进行了研究。结果在发酵液中未发现有明显的蛋白酶活力和任何的果胶酶、几丁质酶及纤维素酶活力。通过以上的实验,使我们对该抑制剂有了进一步的了解,为以后的实验铺平了道路、指明了方向。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 细菌的群体感应（quorum-sensing,QS）
• 1.1.1 细菌群体感应概述
• 1.1.2 革兰氏阴性细菌种内群体感应系统--AHLs系统
• 1.1.3 革兰氏阳性细菌种内群体感应系统--AIP系统
• 1.1.4 细菌种间的群体感应系统--AI-2系统
• 1.1.5 群体感应系统的功能
• 1.2 群体感应AHLs系统的干扰
• 1.2.1 AHLs系统信号干扰
• 1.2.2 AHLs系统信号干扰的应用
• 1.2.3 AHLs系统检测
• 1.3 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）
• 1.3.1 PA的致病机理及耐药机制
• 1.3.2 PA的QS系统
• 1.3.3 对PA的QS系统进行干扰的意义
• 1.4 本实验的目的与创新
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.2 样品制备
• 2.2.1 信号分子（AHLs型）的制备
• 2.2.2 信号分子抑制剂的制备
• 2.3 检测方法
• 2.3.1 检测菌CF11的纯化
• 2.3.2 信号分子活性的检测
• 2.3.3 信号分子抑制剂活性的检测
• 2.4 对信号分子抑制剂进行进一步提纯的方法尝试
• 2.4.1 用醇溶解
• 2.4.2 利用大孔吸附树脂进行分离
• 2.4.3 利用高效液相色谱进行检测
• 2.4.4 利用离子交换树脂进行分离
• 2.5 不同发酵条件对信号分子抑制剂生产的影响
• 2.5.1 信号分子抑制剂生产曲线的测定
• 2.5.2 碳源对信号分子抑制剂生产的影响
• 2.5.3 氮源对信号分子抑制剂生产的影响
• 2.5.4 装液量对信号分子抑制剂生产的影响
• 2.6 测定PAO1的胞外酶活性
• 2.6.1 还原糖标准曲线的绘制
• 2.6.2 酪氨酸标准曲线的绘制
• 2.6.3 粗酶的制备
• 2.6.4 蛋白酶活力测定
• 2.6.5 纤维素酶活力测定
• 2.6.6 果胶酶活力测定
• 2.6.7 几丁质酶活力测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 对信号分子抑制剂的进一步提纯
• 3.1.1 用醇溶解
• 3.1.2 利用大孔吸附树脂进行分离
• 3.1.3 利用高效液相色谱进行检测
• 3.1.4 利用离子交换树脂进行分离
• 3.1.5 对信号分子抑制剂进一步分离纯化的总结
• 3.2 不同发酵条件对信号分子抑制剂生产的影响
• 3.2.1 信号分子抑制剂生产曲线的测定
• 3.2.2 碳源对信号分子抑制剂生产的影响
• 3.2.3 氮源对信号分子抑制剂生产的影响
• 3.2.4 装液量对信号分子抑制剂生产的影响
• 3.3 测定PAO1的胞外酶活性
• 3.3.1 还原糖标准曲线
• 3.3.2 酪氨酸标准曲线
• 3.3.3 蛋白酶活力
• 3.3.4 纤维素酶活力
• 3.3.5 果胶酶活力
• 3.3.6 几丁质酶活力
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢