孕牛外周血中胎儿游离DNA的检测及其在性别鉴定中的应用

论文摘要

目的:在人体,怀孕一定时期的母体中可以检测到胎儿的游历DNA,并可广泛用于非创伤性产前诊断,但在别的动物身上尚未发现类似情况,本实验以奶牛为对象,检测怀孕一定时期奶牛母体外周血中是否存在胎儿游离DNA,如果存在,初步确定其出现的最早时间,尝试利用其特性进行非创伤性产前性别鉴定的可行性。 方法:检测怀孕母牛早、中、晚期共50头,其中怀孕早期奶牛13头、怀孕中期奶牛16头、怀孕后期奶牛21头.应用Primer premier 5.0分别在奶牛SRY基因的3’端、HMG-box内、和包括HMG-box核心序列位点设计三对巢式PCR（六对引物）,采集怀孕不同时期母牛外周血,处理后分别得到血浆和血清,以四种不同的方法（分别为试剂盒提取DNA、普通的苯酚/氯仿提取DNA、加热法提取DNA、直接用血浆/血清作模板）分别提取其中的DNA作为模板,应用灵敏度、敏感性、准确性都比较高的巢式PCR扩增,琼脂糖电泳后,在紫外透射仪下观察结果。 结果:其中怀孕早期胎儿尚未出生,而怀孕中、晚期血浆中检查SRY基因结果与实际性别符合率分别为87.5%（14/16）、95.24%（20/21）,怀孕中、晚期血清中SRY基因检查结果与实际性别符合率分别为75.0%（12/16）、90.48%（19/21）。血浆和血清中胎儿总性别鉴定率分别为91.89%（34/37）和83.87%（31/37）;而以不同的方法提取的DNA模板中又以微量DNA提取试剂盒提取的DNA作模板检出结果与性别符合率最高91.89%（34/37）、加热法提取的DNA次之为83.87%（31/37）、普通的苯酚/氯仿提取的DNA为75.68%（28/37）,直接以血浆为模板未能扩增出目的条带。用三种不同的引物检测结果无明显差异,但是在HMG-box核心序列上的引物由于其序列在不同种属动物中比较保守,因而也可以扩增出小白鼠的SRY基因。 结论:1.怀孕一定时期的奶牛母体外周血中可以检测到胎儿游离DNA,并可用于

论文目录

• 前言
• 1 研究的目的与意义
• 2 哺乳动物早期胚胎性别鉴定的理论依据
• 2.1 细胞遗传学方法
• 2.2 免疫学方法
• 2.3 生物化学方法—X染色体相关酶法
• 2.4 分子生物学方法
• 3 母体外周血中胎儿游离DNA的研究进展
• 3.1 孕妇外周血中胎儿DAN的特点
• 3.2 母体中胎儿游离DNA的检测
• 3.3 母体中胎儿游离DNA在非创伤性产前诊断中的应用
• 3.4 存在的问题及其前景
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要实验仪器及耗材
• 1.3 实验动物
• 2 检测方法
• 2.1 血浆样品的制备
• 2.2 血清样品的制备
• 2.3 试剂及缓冲液的配制
• 2.4 主要实验步骤
• 2.5 奶牛SRY基因巢式PCR引物设计
• 2.6 巢式PCR模板的制备
• 2.7 巢式PCR反应体系的建立
• 2.8 血浆及血清中SRY基因的检测
• 结果与分析
• 1 不同方法提取DNA的结果
• 2 最适巢式PCR条件的建立
• 3 检测结果的特异性
• 4 巢式PCR灵敏度分析
• 5 不同位点引物对检测结果的影响
• 6 从母体血清和血浆中检测胎儿SRY基因的结果
• 7 不同检测方法对胎儿性别的鉴定结果
• 讨论
• 1 怀孕母体中胎儿游离DNA的检测
• 2 SRY基因引物的设计与应用
• 3 产前胎儿的性别鉴定
• 4 检测方法的灵敏度、特异性及准确性的讨论
• 5 母体中胎儿游离DNA检测的应用
• 结论
• 参考文献
• 缩略语
• 致谢
• 作者简历