鱼类融合抗菌肽重组表达载体构建及蛋白表达研究

论文摘要

内源性的抗菌肽是天然免疫的重要组成部分,抗菌肽以其广谱的杀菌作用、高效的抗菌活性、靶菌株难以产生抗药性以及天然、安全等优点,有潜力开发成为具有一种优质、高效、无公害、无残留的新型天然抗生素,应用于海洋水产动物病害防治。论文第一部分设计并合成了三种海洋鱼类抗菌肽Moronecidin-Hepcidin-Pleurocidin融合基因的全序列,在设计过程中考虑了外源基因在原核、真核表达系统中表达所需的一系列因素。成功构建了融合抗菌肽基因的表达载体,包括酵母真核表达载体和原核表达载体,分别在酵母表达体系中和原核表达体系进行表达,以期获得高活性、低成本的水产动物抗菌制剂。论文第二部分对河豚的TLR1胞外区进行了原核表达研究,同时采用改良的重叠延伸PCR方法,成功获得鱼类抗菌肽hepcidin与TLR1的胞外区相融合的重组分子,并构建了重组表达载体,实现在原核表达系统中的表达。研究工作为利用模式识别受体高效识别病原相关分子模式的特点进行构建能够泛特异性识别并富集于病原菌的高效抗菌肽,打下了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述 抗菌肽的研究进展
• 1.抗菌肽的概述
• 2.抗菌肽的来源与分类
• 3.抗菌肽的特性
• 4.抗菌肽的作用机制
• 5.抗菌肽的应用前景
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第一篇 融合抗菌肽MHP基因的设计及其真核、原核表达
• 引言
• 第一章 融合抗菌肽MHP基因的分子设计、基因合成及表达质粒构建
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 融合抗菌肽基因MHP的分子设计
• 1.2.2 融合抗菌肽基因MHP的基因合成
• 1.2.3 融合抗菌肽基因MHP的真核、原核表达质粒构建
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 MHP基因合成及序列验证
• 1.3.2 重组表达质粒的构建
• 第二章 融合抗菌肽MHP的毕赤酵母（Pichia pastoris）表达
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 融合抗菌肽基因MHP毕赤酵母表达重组子的构建
• 2.2.2 融合抗菌肽MHP在毕赤酵母中的表达
• 2.2.3 蛋白表达的检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 pPIC9K-MHP质粒构建
• 2.3.2 毕赤酵母重组子的转化及筛选
• 2.3.3 毕赤酵母表达MHP蛋白
• 第三章 融合抗菌肽MHP的原核表达
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 转化感受态细胞
• 3.2.2 蛋白表达诱导
• 3.2.3 蛋白质凝胶电泳
• 3.3 结果与讨论
• 第二篇 一种靶向性融合抗菌肽的设计及原核表达
• 引言
• 第四章 河豚TLR1（TnTLR1）胞外区的原核表达
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 TLR1胞外区表达质粒的构建
• 4.2.2 TLR1胞外区的原核表达
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 TnTLR1胞外区表达质粒的构建
• 4.3.2 TnTLR1胞外区的原核表达
• 第五章 靶向性抗菌肽的设计、质粒构建及原核表达
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 靶向性抗菌肽hepcidin-TLR1融合基因的获得
• 5.2.2 hepcidin-TLR1表达质粒的构建
• 5.2.3 hepcidin-TLR1的原核表达
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 hepcidin-TLR1表达质粒的构建
• 5.3.2 hepcidin-TLR1的原核表达
• 结语
• 参考文献
• 作者简历