STIM1/TRPC1复合体对EPCs修复损伤血管能力的影响

STIM1/TRPC1复合体对EPCs修复损伤血管能力的影响

论文摘要

1.背景与目的血管内皮损伤和损伤后的不良修复是冠心病、高血压、经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention ,PCI)后再狭窄等血管损伤性疾病发病的共同病理生理基础。如何尽早促进血管损伤后的再内皮化是防治这类疾病形成的关键策略。传统观点认为,内皮损伤的修复主要依靠临近成熟内皮的迁移和增殖,但其增殖能力有限。晚近的研究证实,骨髓和外周血中内皮祖细胞(endothelial progenitor cells ,EPCs)能归巢至损伤血管局部,分化为内皮细胞,促进血管的良性修复。EPCs的增殖、迁移等生物学行为是其修复内皮功能的基础,然而,目前调控EPCs生物学行为的机制,尤其是离子通道方面,仍不清楚。钙离子是调节细胞生理功能比如增殖、分化等的重要物质基础。研究发现,钙离子参与调控EPCs的增殖、归巢及分化功能。钙离子对细胞功能的影响通过胞膜钙通道调控的钙内流来实现,在EPCs这种非兴奋性细胞,由于缺乏电压依赖性钙通道,主要以钙库操纵性钙通道为主(store-operated calcium channals ,SOCs), SOCs由基质交联分子1(stromal interacting molecule 1,STIM1)、Orai和瞬时受体电位通道(transient receptor potential canonical,TRPC)家族构成。STIM1在SOCs中发挥感受器作用,STIM1感受胞内钙库耗竭,激活Orai和TRPC通道,介导钙库操纵性钙内流(store-operated calcium entry ,SOCE),以补充胞内钙。晚近的研究发现,基因沉默STIM1可通过抑制血管平滑肌细胞的增殖而抑制血管损伤后新生内膜的形成。TRPC1抗体也可抑制隐静脉平滑肌细胞增殖导致的新生内膜肥厚。而EPCs作为血管损伤修复中的一重要细胞来源,STIM1及TRPC1是否也通过影响EPCs的功能而参与血管损伤修复过程的调节,目前仍不清楚。我们的前期研究发现,EPCs上有STIM1和TRPC1分子的表达。因此,我们提出假设,STIM1和TRPC1可能参与EPCs增殖、迁移等生物理学形为的调节,从而影响其修复损伤血管的能力。2.方法2.1 STIM1对EPCs修复损伤血管能力的影响2.1.1 STIM1对EPCs增殖、迁移的作用2.1.1.1大鼠骨髓源EPCs的分离培养和鉴定用密度梯度离心法分离大鼠骨髓源的单个核细胞,用含20%FBS的DMEM-L培养基培养。在普通显微镜下观察细胞的形态学特征,荧光双染实验鉴定对DiI-Ac-LDL-和UEA-1均染色阳性的细胞为正在分化的EPCs。用流式细胞术鉴定EPCs表面分子CD34、CD45、CD133、及VEGFR2的表达。2.1.1.2 STIM1对EPCs增殖、迁移的作用分离培养5-7天的大鼠骨髓源EPCs用于实验。将STIM1干扰腺病毒质粒(Ad-si/rSTIM1)、人源STIM1表达质粒(Ad-hSTIM1)及对应的非沉默作用的对照腺病毒(NSC)转染细胞,转染48小时后用于实验。采用细胞计数法和3H-TdR掺入法检测EPCs的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布情况,较正的boyden小室检测细胞的迁移能力。2.1.2观察STIM1对EPCs修复损伤血管能力的影响复制大鼠颈动脉球囊损伤模型,用2%戊巴比妥钠麻醉后,以颈前正中线为切口,暴露左颈总动脉分叉,分离颈外动脉,分别在颈外动脉近、远两侧套线,结扎其远侧。用动脉夹暂时阻断颈内和颈总动脉血流,在颈外动脉结扎近侧穿刺,继之将2F Forgarty导管沿小口送入颈总动脉大约1-2cm,以1.5 atm-2 atm充盈球囊,阻断血流约30秒,然后缓慢来回抽动球囊,反复3次,退出导管,结扎颈外动脉,常规缝合伤口。术后立即经尾静脉注入事先转染Ad-si/rSTIM1、Ad-hSTIM1和NSC并且经Dil-LDL标记的EPCs(1×106)。术后用青霉素预防感染。伊文氏蓝染色观察损伤后7天、14天血管再内皮化。HE染色观察损伤后14天新生内膜的增生情况。2.2观察STIM1与TRPC1相互作用调控EPCs的钙库操纵性钙内流免疫荧光检测TRPC1在EPCs的定位,免疫共沉淀检测STIM1与TRPC1在EPCs的相互作用。RT-PCR和Western blot检测TRPC1的表达,ELISA方法检测STIM1质粒转染后上清中IP3蛋白的表达情况。激光共聚焦检测EPCs内钙变化情况。2.3 TRPC1对EPCs的增殖和迁移的影响及其机制探讨分离培养5-7天的大鼠骨髓源EPCs用于实验。将TRPC1的小RNA干扰质粒(siRNA-TRPC1)及对应的非沉默作用的siRNA对照质粒(siRNA-control)、TRPC1的发夹状RNA干扰质粒(shRNA-TRPC1)及对应的非沉默作用的shRNA对照质粒(shRNA-control)转染细胞,转染48~72小时后用于实验。采用细胞计数法和3H-TdR掺入法检测EPCs的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,较正的boyden小室检测细胞的迁移能力,激光共聚焦检测EPCs内钙变化情况。用细胞周期基因芯片筛选TRPC1干扰质粒转染EPCs 48小时后细胞周期基因的变化情况,筛选TRPC1作用的下游靶点。选择芯片中变化最大的基因激活和或阻断其功能,观察在沉默TRPC1的基础上EPCs的增殖和细胞周期的变化,探讨TRPC1的下游靶点。3.结果3.1 STIM1对EPCs修复损伤血管能力的影响3.1.1 STIM1对EPCs增殖、迁移的影响3.1.1.1大鼠骨髓源EPCs的分离培养和鉴定:成功分离培养大鼠骨髓源性的EPCs,呈梭形、卵圆形、多边形,典型的呈克隆样、线样、血管环样生长。用UEA-I和Dil-Ac-LDL进行染色鉴定,激光共聚焦下观察,摄取Dil-Ac-LDL表现红色荧光,摄取UEA-I表现为蓝色荧光,同时摄取Dil-Ac-LDL和UEA-I的细胞表现黄色荧光,即为双染阳性细胞,表示正在分化的EPCs(N>90%)。通过细胞流式仪检测CD34、CD133、CD45及VEGFR2分子在分离培养5-7天的EPCs上的表达,结果显示VEGFR2 91.24%、CD133 90.58%、CD34 77.32%,而CD45的表达仅4.5%。3.1.1.2 STIM1对EPCs增殖、迁移的影响通过RT-PCR及Western blot方法证实在EPCs上有STIM1的表达,免疫组化提示STIM1主要定位在细胞内。用不同感染复数NSC、Ad-hSTIM1及Ad-si/rSTIM1转染EPCs,并在转染后48小时通过RT-PCR及Western blot检测STIM1的表达,结果显示,Ad-si/rSTIM1转染组(感染复数分别为10MOI和20MOI)STIM1 mRNA和蛋白的表达均较NSC组明显下降(P<0.05),而共转染Ad-si/rSTIM1(10MOI)和Ad-hSTIM1(10MOI)组,STIM1的表达恢复到NSC转染组水平。STIM1对EPCs增殖的影响: Ad-si/rSTIM1转染组3H-TdR掺入量较NSC组显著降低(P<0.05),共转染Ad-si/rSTIM1(10MOI)和Ad-hSTIM1(10MOI)组3H-TdR掺入量恢复到NSC转染组水平。STIM1对EPCs迁移的影响:Ad-si/rSTIM1转染组细胞的迁移数目较NSC转染组显著减少(P<0.05),共转染Ad-si/rSTIM1(10MOI)和Ad-hSTIM1(10MOI)组细胞的迁移数目恢复到NSC转染组水平。STIM1对EPCs细胞周期的分布的影响: Ad-si/rSTIM1转染组,G1期分布的细胞数目较NSC转染组显著增多,S期分布的数目显著减少(P<0.05),而共转染组与NSC组相比无显著差异(P>0.05)。3.1.2 STIM1对EPCs修复损伤血管能力的影响:用Ad-hSTIM1、Ad-si/rSTIM1及NSC转染EPCs后,并用Dil-Ac-LDL标记,将其移植到颈动脉球襄损伤的大鼠模型,分别在7天、14天,用Evans蓝染色检测损伤血管再内皮化率,结果显示Ad-si/rSTIM1转染组再内皮化率较NSC组显著降低(P<0.05),共转染Ad-si/rSTIM1与Ad-hSTIM1组与NSC组相比无明显差别(P>0.05)。HE染色检测新生内膜厚度,结果显示:在损伤后14天,Ad-si/rSTIM1转染组内膜/中膜比值与NSC组相比显著增加(P<0.05),而共转染组与NSC组相比无显著差别(P>0.05)。3.2 STIM1与TRPC1对EPCs的SOCE的影响3.2.1 STIM1对EPCs的SOCE的影响分别用NSC、Ad-si/rSTIM1及Ad-hSTIM1转染EPCs,在转染后48小时,以TG耗竭细胞内钙后,再增加外钙浓度,观察细胞内钙离子浓度变化(以测量的钙离子探针的荧光密度值表示相对钙离子浓度),取增量值加以比较。结果发现在Ad-si/rSTIM1转染组钙离子浓度的增量值相对NSC组明显减少(P<0.05),而共转染组与NSC组相比无明显差别(P>0.05)。3.2.2 TRPC1-SOCs参与STIM1对EPCs钙内流的调节我们通过RT-PCR、Western blot证实EPCs上有TRPC1的表达,免疫组化提示TRPC1主要定位在细胞膜。此外,免疫共沉淀检测结果显示用STIM1与TRPC1在EPCs相互作用形成复合体,且在TG的剌激下相互作用增强。为了明确STIM1表达变化是否影响TRPC1的表达,我们检测各转染组TRPC1的表达,结果显示Ad-si/rSTIM1转染组TRPC1的表达相对NSC组下降(P<0.05)。而Ad-si/rSTIM1+ Ad-hSTIM1共转染组TRPC1的表达恢复到NSC组的水平。为了检测TRPC1的SOCs还是受体操纵性钙通道(ROC)参与STIM1对EPCs的SOCE的调节,我们用ELASA法检测各转染组IP3浓度(TRPC1-ROC受IP3激活),结果显示各转染(Ad-si/rSTIM1、Ad-si/rSTIM1+ Ad-hSTIM1及NSC)组无明显差别,间接提示TRPC1的SOCs参与STIM1对EPCs的SOCE的调节。3.3. TRPC1对EPCs增殖、迁移的影响及机制。3.3.1 TRPC1对EPCs增殖、迁移的影响EPCs分别转染siRNA-TRPC1、shRNA-TRPC1及相应的阴性对照siRNA-control及shRNA-control。48小时后观察TRPC1的表达,结果显示两种不同转染质粒转染组TRPC1的表达较相应对照组均显著下降(P<0.05)。转染后各组细胞的增殖及迁移情况:在siRNA-TRPC1及shRNA-TRPC1转染组3H-TdR掺入量较对照组显著下降(P<0.05),同时细胞计数也较对照组显著下降(P<0.05),而细胞迁移数目也较对照组显著下降(P<0.05)。我们通过流式细胞术检测TRPC1对EPCs的细胞周期的影响,结果显示:在siRNA-TRPC1及shRNA-TRPC1转染组细胞分布在G1期数目较对照组显著增多(P<0.05),而分布在S期的细胞数目较对照组显著减少(P<0.05)。转染后各组细胞的SOCE情况:在siRNA-TRPC1及shRNA-TRPC1转染组均明显抑制了EPCs的SOCE。3.3.2 TRPC1对EPCs的细胞周期基因表达的影响通过基因芯片检测TRPC1对EPCs的细胞周期基因表达的影响,结果发现在siRNA-TRPC1转染组相对对照组有9个基因上调,4个基因下调,上调基因包括Ak1、Brca2、Camk2b、p21、Ddit3、Inha、Slfn1、Mdm2、Prm1。下调基因包括Bcl2, Mki67, Pmp22, Ppp2r3a。其中变化最明显的基因是Slfn1(上调9.4倍)。3.3.3 Slfn1在TRPC1对EPCs增殖中的作用由于Slfn1是变化最明显的基因,我们通过PCR和Western blot方法也证实Slfn1在siRNA-TRPC1转染组相对对照组上调9倍左右。因此我们对Slfn1进行下一步的功能实验,在TRPC1沉默的基础上,通过Slfn1封闭肽阻断Slfn1的功能,观察对EPCs增殖和细胞周期的影响。结果发现:在TRPC1沉默的基础上,用Slfn1封闭肽阻断Slfn1功能组, 3H-TdR掺入量及细胞计数均恢复到空白对照组水平,此外,细胞周期分布也部分恢复到空白对照组水平。由此说明Slfn1是TRPC1对EPCs作用的下游靶点。4.结论本研究主要结论:4.1基因沉默STIM1负性调控EPCs修复损伤血管的能力。4.2 STIM1与TRPC1在EPCs相互作用形成复合体,共同调节EPCs的SOCE。4.2基因沉默TRPC1负性调控EPCs修复损伤血管的能力。

论文目录

  • 英文缩写一览表
  • 英文摘要
  • 中文摘要
  • 前言
  • 第一部分 STIM1 对EPCs 修复损伤血管能力的影响
  • 实验一 STIM1 对EPCs 增殖、迁移的影响
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 结果
  • 讨论
  • 结论
  • 实验二 STIM1 对EPCs 修复损伤血管能力的影响
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 结果
  • 讨论
  • 结论
  • 第二部分 STIM1/TRPC1 复合体对EPCs 的SOCE 的影响
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 结果
  • 讨论
  • 结论
  • 第三部分 TRPC1 对EPCs 增殖、迁移的影响及机制
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 结论
  • 全文结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 文献综述一 TRPC1 与心血管疾病关系研究进展
  • 参考文献
  • 文献综述二 STIM1 与心血管疾病
  • 参考文献
  • 博士就读期间发表的文章
  • 附录一
  • 附录二
  • 相关论文文献

    标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  

    STIM1/TRPC1复合体对EPCs修复损伤血管能力的影响
    下载Doc文档

    猜你喜欢