抗变性胰岛素单克隆抗体的制备及初步应用

论文摘要

目的：制备小鼠抗变性胰岛素单克隆抗体,对其特性进行初步鉴定并建立ELISA检测方法。方法：以变性后的生物合成人胰岛素为免疫原,经背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。采用棋盘滴定法确定抗原最佳包被浓度及二抗工作浓度,建立一种ELISA测定方法。通过间接ELISA法检测免疫小鼠血清效价,选取血清效价高的小鼠用于单克隆抗体的制备。无菌分离免疫小鼠的脾脏,制成单个细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合。融合过程用聚乙二醇（PEG）行细胞融合,用杂交瘤细胞选择性培养基次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷（HAT）及次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷（HT）进行选择性培养。通过间接ELISA法检测培养上清,筛选出10株阳性值高且生长状态好的融合细胞,采用有限稀释法进行克隆培养；间接ELISA法筛选可特异性分泌抗变性胰岛素单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）的杂交瘤细胞。扩大培养分泌抗变性胰岛素单克隆抗体的细胞株。间接ELISA法检测杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性及冻融前后的抗体效价；并用杂交瘤细胞体内诱生法从小鼠腹腔制备腹水,经正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体。Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定McAb的Ig类与亚类：用ELISA和western blot鉴定McAb的特异性。利用制备出的单克隆抗体建立ELISA检测方法,以糖尿病患者和正常人为研究对象,检测血清中变性胰岛素的水平。结果：采用棋盘滴定法确定抗原的最佳包被浓度为10μg/ml。最佳二抗工作浓度为1：5000。融合后经HAT培养液筛选出10株抗体滴度较高的杂交瘤细胞。经克隆及亚克隆培养,8株克隆失去产生抗体的能力,最终获得2株可稳定分泌抗胰岛素McAb的杂交瘤细胞,分别命名为INS1G9和INS3D7。这两株杂交瘤稳定性良好,体外连续培养3个月及冻存复苏后均能稳定分泌McAb。间接ELISA法检测两株细胞冻融前后所产生的抗体效价分别为1：8000和1：5000。通过动物体内诱生腹水法大量制备出单克隆抗体。腹水效价分别达到105和106。用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水得到较高纯度的抗体。经单克隆抗体亚类试剂盒鉴定其分泌的McAb均为IgG1。ELISA方法检测,抗体与变性胰岛素能发生抗原抗体反应,而与胰岛素原和C-肽无交叉反应。Western blot分析表明,所制备的单克隆抗体可与转印至膜上的目的蛋白形成单一条带,所识别的靶分子的相对分子质量（Mr）约为6KD,证实所获得的McAb有较高的特异性。以两种单克隆抗体初步建立双抗体夹心ELISA法,初步实验显示2型糖尿病患者血清检测值较正常组高。结论：成功地获得了两株分泌抗变性胰岛素单克隆抗体的细胞株,（分别为INS1G9和INS3D7）,成功制备出抗变性胰岛素的单克隆抗体。初步建立双抗体夹心法检测血清中抗变性胰岛素水平,发现2型糖尿病患者血清变性胰岛素检测水平较正常组高,差别有统计学意义。1型糖尿病、2型糖尿病和正常人血清中变性胰岛素水平存在差异。为进一步的研究奠定了有效地实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的和方法
• 抗变性族岛素单克隆抗体的制备及初步应用
• 1 对象与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢