鲤鱼肌肉金属蛋白酶的分离纯化与性质分析

论文摘要

蛋白酶是催化多肽或蛋白水解的酶的统称。根据蛋白酶活性部位的性质不同,蛋白酶可以分为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶。金属蛋白酶（Metalloproteinase）是一类活性中心金属离子和其他氨基酸残基组成的蛋白酶。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）是能够降解细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）的最重要的Zn2+依赖性金属蛋白酶。研究发现,MMPs参与鱼死后软化过程中细胞外基质蛋白的降解。迄今为止,国内淡水鱼肌肉中基质金属蛋白酶的研究还未见报道。本文以淡水鲤鱼为研究对象,分析肌肉中金属蛋白酶的存在情况、酶学性质,实现了金属蛋白酶的高度纯化并对其性质进行深入的分析,为MMPs在鱼类肌肉中的生理学功能的进一步研究提供了理论依据,为研究鱼死后肌肉软化机理提供理论依据,填补了国内在淡水鱼肌肉基质金属蛋白酶研究领域的空白。利用明胶酶谱对鲤鱼肌肉中的基质金属蛋白酶进行研究,在60 kDa到97 kDa之间,发现鲤鱼肌肉中分别存在两种降解明胶的酶,且红色肉中的酶活性远高于白色肉。用基质金属蛋白酶激活剂APMA处理后,产生了其它的活性形式,说明这些活性是基质金属蛋白酶的酶原和活性形式。金属离子螯合剂EDTA、EGTA和1,10-phenanthroline能有效抑制其活性,而其他抑制剂没有明显抑制作用,因此,这些酶是金属蛋白酶。采用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析、Econo-Pac Macro-Prep High Q离子交换层析和Gelatin SepharoseTM 4B亲和层析等方法,从鲤鱼红色肌肉中分离纯化得到三种MMPs。它们的分子量分别为75 kDa、67 kDa和64 kDa。三者的最适反应温度约为40℃,最适pH为8.0。金属螯合剂EDTA, EGTA和1,10-phenanthroline能有效抑制其活性,而其他抑制剂没有明显抑制作用,Ca2+能够促进这些酶的活性,此外,这些酶可以高效降解胶原蛋白,但不能降解肌原纤维蛋白。同时,我们还发现鲤鱼肌肉中存在肌原纤维结合型金属蛋白酶,这为研究肌原纤维蛋白的降解提供了新途径,有助于研究肌原纤维蛋白的降解。通过一年间季节变化的实验发现,鲤鱼红色肉肌球蛋白重链的自身降解比白色肉明显。金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA能够有效抑制肌球蛋白的降解,金属离子Cu2+和Mn2+对肌原纤维的降解有很强的促进作用,而Zn2+和Ge2+对肌原纤维降解有一定的抑制作用。因此,金属蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解起主要作用,即鲤鱼肌肉中存在肌原纤维结合型金属蛋白酶。同时,该酶的活力与季节变化密切相关。总的来说,本文的创新有以下三点:1.将鲤鱼肌肉中的红色肉和白色肉分开进行研究,比较其中金属蛋白酶活性,并发现红色肉中金属蛋白酶的活性比白色肉强;2.首次从鲤鱼红色肉中纯化得到降解胶原蛋白的基质金属蛋白酶,并对其生化性质做了详细的研究;3.首次从发现鲤鱼肌原纤维蛋白中存在肌原纤维结合型金属蛋白酶（MBMP）,研究了MBMP活性的季节性变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 金属离子与酶
• 1.2 金属蛋白酶研究概况
• 1.2.1 MMPs 简介
• 1.2.1.1 细胞外基质（ECM）
• 1.2.1.2 MMPs 的结构
• 1.2.1.3 MMPS 的分类和特点
• 1.2.1.4 MMPs 的活性调节
• 1.2.1.5 MMPs 的功能
• 1.2.1.6 MMPs 的分布与纯化
• 1.2.2 其他金属蛋白酶
• 1.3 金属蛋白酶在食品中的研究现状
• 1.3.1 MMPs 与肉类品质的关系
• 1.3.2 MMPs 对水产品品质的影响
• 1.3.3 其他金属蛋白酶与食品的关系
• 1.4 鱼类肌肉蛋白
• 1.5 本文研究内容与意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验用鱼
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验所用溶液及其制备
• 2.1.3.1 Tris-HCl 缓冲液
• 2.1.3.2 SDS-PAGE 所用溶液
• 2.1.3.3 8 g/L 明胶的配制
• 2.1.3.4 2.5 % （V/V）的Triton X-100 溶液的配制
• 2.1.3.5 银染色所用溶液
• 2.1.3.6 Western Blot 所用溶液
• 2.1.4 实验所用仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 酶活的测定
• 2.2.2 蛋白浓度测定
• 2.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、明胶酶谱（Gelatin Zymography）、银染色以及免疫交叉反应（Western Blot）
• 2.2.3.1 SDS-PAGE 胶的制备
• 2.2.3.2 酶的电泳检测及分析
• 2.2.3.3 明胶酶谱胶的制备
• 2.2.3.4 酶的酶谱检测和分析
• 2.2.3.5 SDS-PAGE 的银染色
• 2.2.3.6 Western Blot
• 2.2.4 鲤鱼肌肉肌浆中金属蛋白酶活性分析
• 2.2.4.1 原料预处理
• 2.2.4.2 红色肉和白色肉金属蛋白酶活性比较
• 2.2.4.3 红色肉金属蛋白酶的APMA 激活
• 2.2.4.4 酶液的提取
• 2.2.4.5 明胶的不同时间降解
• 2.2.4.6 不同温度的影响
• 2.2.4.7 不同pH 的影响
• 2.2.4.8 不同蛋白酶抑制剂的抑制作用
• 2.2.4.9 不同金属离子的影响
• 2.2.5 鲤鱼肌肉肌浆中金属蛋白酶的纯化
• 2.2.5.1 原料预处理
• 2.2.5.2 样品预处理
• 2.2.5.3 硫酸铵分级沉淀
• 2.2.5.4 DEAE-Sephacel 离子交换层析
• 2.2.5.5 Sephacryl S-200 HR 凝胶过滤层析
• 2.2.5.6 Econo-Pac Macro-Prep High Q 阴离子交换层析
• TM 4B 亲和层析'>2.2.5.7 Gelatin Sepharose^TM 4B 亲和层析
• 2.2.6 性质分析
• 2.2.6.1 分子量的确定和纯度鉴定
• 2.2.6.2 最适温度
• 2.2.6.3 最适pH
• 2.2.6.4 各种蛋白酶抑制剂的抑制作用
• 2.2.6.5 金属离子对酶活性的影响
• 2.2.6.6 胰蛋白酶对酶的激活作用
• 2.2.6.7 APMA 对酶的激活作用
• 2.2.6.8 酶对胶原蛋白的降解
• 2.2.6.9 酶对明胶的降解
• 2.2.6.10 酶对肌原纤维的降解
• 2.2.7 鲤鱼肌肉中肌原纤维结合型金属蛋白酶的研究
• 2.2.7.1 原料预处理
• 2.2.7.2 鲤鱼肌原纤维的制备
• 2.2.7.3 鲤鱼肌肉肌原纤维的自身降解
• 2.2.7.4 各种抑制剂的抑制作用
• 2.2.7.5 金属离子对肌原纤维降解的影响
• 2.2.7.6 鲤鱼肌肉肌原纤维的自身降解作用的季节性变化
• 第三章 结果与分析
• 3.1 鲤鱼肌肉中金属蛋白酶活性分析
• 3.1.1 鲤鱼红色肉和白色肉中金属蛋白酶活性比较
• 3.1.2 红色肉金属蛋白酶的APMA 激活
• 3.1.3 酶液的提取
• 3.1.4 鲤鱼肌肉金属蛋白酶的性质分析
• 3.1.4.1 明胶的不同时间降解
• 3.1.4.2 温度对明胶降解的影响
• 3.1.4.2 pH 对明胶降解的影响
• 3.1.4.3 不同蛋白酶抑制剂的抑制作用
• 3.1.4.4 不同金属离子对酶活性的影响
• 3.2 鲤鱼红色肉中金属蛋白酶的分离纯化与性质分析
• 3.2.1 纯化结果
• 3.2.2 性质分析
• 3.2.2.1 分子量的确定和纯度鉴定
• 3.2.2.2 最适温度
• 3.2.2.3 最适pH
• 3.2.2.4 各种蛋白酶抑制剂的抑制作用
• 3.2.2.5 金属离子对酶活性的影响
• 3.2.2.6 胰蛋白酶对酶的激活的作用
• 3.2.2.7 APMA 对酶的激活的作用
• 3.2.2.8 酶对胶原蛋白的降解
• 3.2.2.9 酶对明胶的降解
• 3.2.2.10 酶对肌原纤维的降解
• 3.3 鲤鱼肌肉MBMP 的研究
• 3.3.1 鲤鱼肌肉肌原纤维的自身降解作用
• 3.3.1.1 不同温度的降解及红色肌肉与白色肌肉的比较
• 3.3.1.2 55 ℃不同时间的降解及红色肉与白色肉降解速度的比较
• 3.3.2 各种抑制剂的抑制作用
• 3.3.4 金属离子对鲤鱼肌肉肌原纤维降解的影响
• 3.3.5 鲤鱼红色肉肌原纤维自身降解的季节性变化
• 第四章 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.2 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文目录