非寄主抗性基因介导水稻抗细菌性条斑病的分子机理及水稻抗白叶枯病材料的筛选和QTL定位

论文摘要

由Xanthomonas.oryzae pv. oryzicola（Xoc）引起的细菌性条斑病和由X. oryzae pv. oryzae（Xoo）引起的白叶枯病是水稻生产中危害严重的两种细菌性病害。白叶枯病菌与水稻抗病基因之间存在典型的特异性互作,培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病最有效手段之一。Xoc与Xoo亲缘关系相近,但是水稻在细菌性条斑病抗性改良方面进展缓慢,其主要原因是水稻对Xoc的抗性由多基因控制。随着分子生物学技术的发展,利用非寄主抗性基因可能是培育广谱持久抗病品种的新途径。本研究一方面利用农杆菌介导法将从玉米中克隆的细菌性条斑病非寄主抗性基因Rxo1导入到水稻中,采用全基因组芯片和RT-PCR等方法分析了转基因水稻株系抗细菌性条斑病的分子机理;另一方面采用Xoo代表菌株人工接种水稻回交群体,筛选抗白叶枯病水稻株系,定位数量抗性座位（QTL）。主要研究结果如下:1.携带非寄主抗性基因Rxo1的转基因植株接种Xoc后产生典型的HR表型。组织学分析发现转基因植株的叶片接种后木质素、胼胝质和酚类等基础抗病物质积累增加;过氧化物酶和β-1,3葡聚糖酶等酶类的活性提高。2.利用Affymetrix全基因组芯片,分析Rxo1转基因植株（9804-Rxo1）及其受体（9804）接种Xoc后基因表达谱,鉴定了可能参与抗病反应的主要基因。结果表明接种后36h,在9804-Rxo1和9804中分别有175个和379个基因差异表达,其中175个（ Differentially expressed gemes, DRGs）中92.00%的为上调,且多达48.22%的DRGs为防御反应相关基因。在转基因植株中过氧化物酶（Peroxidase, POD）、脂氧合酶（lipoxygenase 2.1, LOX）、病原相关蛋白和萜烯合酶家族蛋白以及C2H2、WRKY与myb类转录因子接种后诱导表达。接种后48h,9804-Rxo1和9804的DRGs分别为2450和1950个,其中HR和SA、ET信号传导途径的关键基因在转基因植株中显著差异表达;SAPK和PPR家族的基因、WRKY和MYB转录因子可能参与抗病反应。3.分析了SAPK家族基因在携带寄主R基因和非寄主R基因水稻株系中的表达谱。携带Rxo1的植株接种Xoc后,4个SAPK上调表达,其中SAPK9快速持续地高水平表达;携带白叶枯抗病基因Xa23的植株接种Xoo后,4个SAPK被诱导表达。此外,抗性株系接种后內源ABA水平上升;结合蛋白质序列分析,推测motif 6 （GM[DE]MPIMHD[GS]DR）和/或motif 7 （IN[QH][FI]L[TN]D[GS]LDDDM）可能与ABA反应相关。4.用8个非目标性状优良的水稻回交群体,人工接种14个Xoo代表菌株,筛选获得23个广谱抗性株系;定位到了65个白叶枯病各小种抗性相关的QTL（包括13个主效QTL）,有25个标记至少在3个不同的群体或同一群体的不同菌株环境下被定位到;这25个标记中有9个等位基因的抗性来源于轮回亲本HHZ（加性效应为正）;另9个的抗性来源于各供体,其余的7个标记的抗性来源因菌株而异。本研究从分子水平证明了非寄主抗性基因可以在异种植物中介导HR反应,暗示寄主抗病基因和非寄主抗性基因可能有部分相同的抗病分子机制,为深入研究非寄主抗性基因抗病机理提供了理论基础;同时筛选到的广谱抗白叶枯病材料和定位到的主效QTL将为通过分子育种手段改良水稻品种的白叶枯病抗性提供基础材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 植物的抗病性
• 1.1.1 植物的部分抗性和完全抗性
• 1.1.2 抗性基因与无毒基因及“基因对基因”假说
• 1.1.3 非寄主抗性研究进展
• 1.2 水稻对白叶枯病和水稻细菌性条斑病的抗性遗传研究进展
• 1.2.1 白叶枯病抗性遗传基础
• 1.2.2 水稻白叶枯病抗性基因
• 1.2.3 水稻白叶枯病QTL 定位
• 1.2.4 水稻细条病抗性遗传及抗性QTL 和基因
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 转 Rxo1 基因抗细菌性条斑病水稻的获得及抗病性鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料与双元载体
• 2.1.2 水稻的遗传转化
• 2.1.3 细菌性条斑病菌株的分离培养与接种鉴定
• 2.1.4 木质素、酚类物质及胼胝质染色
• 2.1.5 过氧化物酶类、β-1,3 葡聚糖酶及脂氧合酶的酶活测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 Rxo1 基因及其编码蛋白
• 2.2.2 转基因植株的表型鉴定和分子鉴定
• 2.2.3 木质素、酚类物质及胼胝质染色反应
• 2.2.4 POD、β-1,3 葡聚糖酶及LOX 的酶活变化
• 2.3 讨论
• 2.3.1 抗性反应中的物理化学防卫屏障
• 2.3.2 被动防御机制中的抗菌化合物
• 2.3.3 转基因植株中的基础防御反应
• 第三章 Rxo1 基因介导的水稻抗细菌性条斑病全基因组表达谱 分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料与接种
• 3.1.2 植物总RNA 提取
• 3.1.3 芯片杂交与数据分析
• 3.1.4 RT-PCR 及qRT-PCR 分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转基因植株的抗病反应
• 3.2.2 9804-Rxo1 和9804 接种后的差异基因表达谱
• 3.2.3 9804-Rxo1 和9804 差异表达基因分类
• 3.2.4 接种后9804-Rxo1 差异表达的防御相关基因
• 3.2.5 9804-Rxo1 和9804 差异表达的转录因子
• 3.2.6 Rxo1 介导的转录后调控相关基因PPR 及RRM
• 3.3 讨论
• 3.3.1 非寄主抗性基因介导的HR
• 3.3.2 非寄主抗性介导的SA 和JA 等基本防御反应
• 3.3.3 非寄主抗性过程中的早期反应与PPR
• 第四章 SAPK 家族基因在水稻抗细菌性条斑病和白叶枯病反应中的差异表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料和RNA 的提取
• 4.1.2 SAPK 家族基因序列的测定及蛋白质结构分析
• 4.1.3 SAPK9 亚细胞定位
• 4.1.4 水稻叶片內源ABA 含量测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 SAPK 家族基因的核酸序列分析及系统发育树构建
• 4.2.2 OsSAPKs 启动子分析
• 4.2.3 SAPK9-YFP 瞬时表达
• 4.2.4 病原细菌侵染后OsSAPKs 的表达谱
• 4.2.5 ABA 含量与抗病性
• 4.3 讨论
• 4.3.1 蛋白质激酶与SAPK
• 4.3.2 SAPK 激酶在抗病反应中的表达
• 4.3.3 SAPK 激酶与ABA
• 第五章 利用非目标性状导入系筛选高抗白叶枯病的水稻株系及定位抗性QTL
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料与菌株
• 5.1.2 白叶枯病表型鉴定方法
• 5.1.3 基因型分析
• 5.1.4 数据分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 抗感频率分布及相关性分析
• 5.2.2 抗性株系筛选
• 5.2.3 白叶枯病抗性QTL 定位
• 5.2.4 主效QTL 与表型变异
• 5.3 讨论
• 5.3.1 实验材料与QTL 定位效率
• 5.3.2 “隐蔽有利基因”与“遗传搭车效应”
• 5.3.3 广谱抗性株系的利用
• 5.3.4 QTL 定位与环境效应和背景效应
• 5.3.5 主效QTL 比较分析
• 第六章 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历