检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体Cap重组蛋白芯片技术的研究

论文摘要

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）为无囊膜的单股负链DNA病毒,是目前发现的最小的动物病毒。PCV根据抗原性及序列分析的不同分为PCVⅠ和PCVⅡ两种基因型。目前国内针对PCVⅡ病毒的抗体检测方法主要包括:病毒分离鉴定、聚合酶链式反应技术、间接免疫荧光试验、原位杂交试验、免疫组化试验、酶联免疫吸附试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验等。蛋白质芯片技术（Protein chip）亦被称为蛋白微阵列（Protein Microarrays）是一种能满足生物样本同时多指标分析的需要,既保留了抗原-抗体反应的快速、灵敏和特异性,又具备芯片技术高通量、低成本、高平行、微型化和极高的灵敏度等特点的新技术。目前蛋白质芯片技术已经成为动物疫病诊断的新方向。本研究建立了猪圆环病毒Ⅱ型病毒的目视化重组蛋白质芯片及FITC信号芯片,此两种可以特异性的检测出猪血清中猪圆环病毒Ⅱ型病毒特异抗体。研究内容主要包括:1.重组蛋白抗原的制备:应用PCR方法扩增得到了一株猪圆环病毒Ⅱ型病毒的CAP基因,连接至pMD-18载体上,转化到Jm109大肠杆菌中,将其质粒双酶切,经T4连接酶连接到pET30a载体中,经PCR、酶切及测序验证正确后,转化至BL21（DE3）大肠杆菌中,加入适当浓度的IPTG进行诱导。将诱导后的菌液超声波裂解,通过NI-NTA偶联的亲和层析柱亲和层析纯化、浓缩。最后,重组蛋白复性,通过免疫印迹表明重组的CAP蛋白具有良好的抗原性。2.可视化芯片的制作及条件优化:将纯化的蛋白抗原点样于醛基修饰的玻璃载片表面,并对芯片的制备条件,捕获抗原浓度、一抗、二抗浓度,及显影液的混合比例进行优化。最后,确定了芯片的检测限及检测区间,并进行重复试验。3.FITC标记芯片的制作及条件优化:将纯化的蛋白抗原用点样仪点到醛基修饰的玻璃载片表面,并对并对芯片的制备条件,捕获抗原浓度,一抗、二抗浓度进行优化。最后,确定了芯片的检测限及检测区间,并进行重复试验。应用所制备的两种蛋白质芯片和商品化试剂盒检测60份现地样本,进行符合性检测,结果显示两种芯片与商品化试剂盒的检测率均有较高符合率。试验结果显示所构建的两种芯片样点形态规则,敏感度较高,且具有良好的再现性和较小的变异度,其线形检测区间同比与间接ELISA方法更宽,灵敏度约为相同捕获抗原建立的间接ELISA的2倍。此两种芯片的建立为推进了蛋白质芯片技术应用于兽医疫病的临床检测的步伐。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 猪圆环病毒简介
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 猪圆环病毒生物学特征
• 1.1.3 猪圆环病毒Ⅱ流行病学研究进展
• 1.1.4 猪圆环病毒Ⅱ的致病的治病机理
• 1.1.5 猪圆环病毒Ⅱ感染的诊断研究进展
• 1.1.6 猪圆环病毒Ⅱ的疫苗研究进展
• 1.2 蛋白质芯片研究进展
• 1.2.1 探针的制备
• 1.2.2 芯片载体的选择
• 1.2.3 点样方式
• 1.2.4 蛋白质芯片检测方法
• 1.2.5 蛋白质芯片技术在兽医上的应用
• 1.3 研究目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 蛋白抗原的表达、纯化及抗原性鉴定
• 2.1.1 材料和方法
• 2.2 蛋白质芯片的制作及制作条件的优化
• 2.2.1 材料和方法
• 2.2.2 可视化蛋白质芯片的制作及制作条件的优化
• 2.2.3 FITC标记的蛋白质芯片的制作及制作条件的优化
• 2.3 可视化蛋白质芯片与FITC标记蛋白质芯片重复性试验
• 2.4 检测区间及检测限的确定及比较
• 2.4.1 可视化蛋白质芯片检测区间及检测限的确定
• 2.4.2 FITC标记蛋白质芯片检测区间及检测限的确定
• 2.4.3 间接ELISA检测区间及检测限的确定
• 2.4.4 间接ELISA检测与可视化蛋白质芯片检测灵敏度对比
• 2.4.5 间接ELISA检测与FITC标记蛋白质芯片检测灵敏度对比
• 2.4.6 可视化蛋白质芯片与FITC标记蛋白质芯片检测灵敏度对比
• 2.5 符合性试验
• 2.5.1 商品化试剂盒检测检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体
• 2.5.2 可视化蛋白质芯片检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体
• 2.5.3 FITC标记蛋白质芯片检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体
• 2.5.4 检测结果符合率
• 2.6 蛋白质芯片结果判定期限
• 2.6.1 可视化蛋白质芯片结果可判定期限
• 2.6.2 FITC标记蛋白质芯片保存期限检测
• 3 结果
• 3.1 蛋白抗原的表达、纯化及抗原性鉴定
• 3.1.1 间接免疫荧光试验
• 3.1.2 猪圆环病毒全基因、Cap基因的扩增
• 3.1.3 PET30a-Cap质粒的构建
• 3.1.4 重组质粒PET30a-Cap的鉴定
• 3.1.5 重组Cap蛋白的纯化及诱导表达条件的优化
• 3.1.6 重组蛋白的Western Blotting鉴定
• 3.1.7 重组蛋白的浓度测定
• 3.2 蛋白质芯片的制作及制作条件的优化
• 3.2.1 可视化蛋白质芯片的制作及优化
• 3.2.2 FITC标记蛋白质芯片的制作及优化
• 3.3 可视化蛋白质芯片及FITC标记蛋白质芯片的重复性试验
• 3.4 检测区间及检测限的确定及比较
• 3.4.1 可视化蛋白质芯片检测区间及检测限的确定
• 3.4.2 FITC标记蛋白质芯片检测区间及检测限的确定
• 3.4.3 间接ELISA检测区间及检测限的确定
• 3.4.4 间接ELISA检测与可视化蛋白质芯片检测灵敏度对比
• 3.4.5 间接ELISA检测与FITC标记蛋白质芯片检测灵敏度对比
• 3.4.6 可视化蛋白质芯片与FITC标记蛋白质芯片检测灵敏度对比
• 3.5 符合性试验
• 3.5.1 商品化试剂盒检测检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体
• 3.5.2 可视化蛋白质芯片检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体
• 3.5.3 FITC标记蛋白质芯片检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体
• 3.5.4 检测结果符合率
• 4 讨论
• 4.1 蛋白抗原的表达、纯化及抗原性鉴定的结果
• 4.2 蛋白质芯片的制作及优化
• 4.2.1 可视化蛋白质芯片
• 4.2.2 FITC标记蛋白质芯片
• 4.3 检测区间及检测限的确定及比较
• 4.4 符合性试验
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文