论文摘要
大肠癌是常见的恶性肿瘤之一。2010年美国大肠癌新发病例数和死亡病例数均居美国恶性肿瘤发病谱和死亡谱的第3位。尽管在美国近年来大肠癌的发病率以每年3%的速度下降,但在我国,特别是在东部沿海及大城市大肠癌的发病率仍在不断上升；靶向药物的开发应用使得部分晚期大肠癌的生存超过了2年以上,但总体大肠癌的5年生存率没有得到显著的提高。影响大肠癌患者生存的主要因素是肿瘤诊断延迟而出现的肿瘤转移,因此,一方面继续加强早期诊断、早期治疗,另一方面,深入研究肿瘤浸润转移的发生机理,并且进行有效的干预对提高肿瘤的5年生存率具有积极的意义。肿瘤转移是一个复杂的、多因素调控的动态过程,对于肿瘤转移机制的研究将有助于深入了解转移过程,并可以鉴定到有意义的治疗靶标,为临床诊断和治疗奠定基础。肿瘤的转移过程包括：细胞外基质的识别、细胞外基质的降解、细胞迁移、脉管内转运播散、靶向性转移器官的选择等。人血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4）是一种分泌型糖蛋白,其由406个氨基酸组成,相对分子质量为45.2Kda,N端有卷曲螺旋结构域,C端有纤维蛋白原样结构域,含有一糖基化位点。ANGPTL4的表达受营养、激素和缺氧调控,其中过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferartor-activated receptor, PPAR）和缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）被认为是ANGPTL4的关键调控基因。ANGPTL4蛋白主要在脂肪组织和胚胎中表达,不同器官来源的脂肪组织中表达不同,ANGPTL4在肺、肾、肝脏、垂体、骨骼肌和心脏中也有表达,目前ANGPTL4主要明确的功能是调节血管生成、脂肪代谢及糖代谢。ANGPTL4然后也被发现在多种肿瘤组织中表达,而且在恶性肿瘤组织中,ANGPTL4主要表达于坏死灶边缘。对ANGPTL4在肿瘤转移中的作用还存在许多争论,在大肠癌的研究中少见报道。为了进一步研究ANGPTL4在大肠癌进展中的作用,我们用半定量RT-PCR法检测了ANGPTL4在大肠癌组织标本及细胞株中的表达,并且通过建立高表达及基因沉默细胞株分析ANGPTL4表达对大肠癌细胞生物学行为的影响,包括细胞增殖能力MTT分析、软琼脂克隆形成能力、Transwell细胞迁移能力、F-actin免疫荧光染色等；并分析影响产生细胞行为改变的分子基础。结果：1)检测了41例结直肠癌患者的肿瘤组织及正常肠粘膜的ANGPTL4mRNA的表达：发现ANGPTL4mRNA在肿瘤组织中阳性表达17例,阳性表达率41.5%（17/41）；而在配对的正常肠粘膜中表达为8例,阳性表达率19.5%（8/41）,两组之间显著性差异（P≤0.05）; ANGPTL4mRNA的表达与患者的性别、年龄、肿瘤分化、淋巴结转移及分期无明显相关,但与肿瘤的体积相关,即在ANGPTL4表达组其平均肿瘤体积明显大于表达阴性组（P<0.05）；2)检测了7个结肠癌细胞株的ANGPTL4mRNA的表达：ANGPTL4mRNA在DLD1,SW480,HT29中高表达；HCT116和SW620几乎不表达；RKO和COLO320中等表达；3)构建了稳定高表达ANGPTL4的结肠癌细胞株HCT116/ANGPTL4,及ANGPTL4沉默的细胞株HT29/shRNA-ANGPTL4;4) HCT116/ANGPTL4的生物学行为表现为：细胞软琼脂克隆形成能力减弱；MTT分析细胞增殖无明显差异;Transwell实验发现细胞移动能力明显增加；F-actin免疫荧光发现细胞伪足形成增多;5) HT29/shRNA-ANGPTL4的生物学行为表现为：细胞软琼脂克隆形成能力增加；MTT分析细胞增殖无明显差异；Transwell实验发现细胞移动能力明显减弱；F-actin免疫荧光发现细胞伪足形成明显减少；6) Western Blot实验发现HCT116/ANGPTL4细胞骨架调节蛋白ERM, pho-ERM, VASP的表达明显上调,而细胞粘附分子E-Cadherin的表达明显下降；HT29/shRNA-ANGPTL4则表现为细胞骨架调节蛋白ERM, pho-ERM, VASP的表达明显下降,CD44表达下降；7) HCT116/ANGPTL4细胞的裸鼠体内肿瘤生长能力明显抑制；结论ANGPTL4的表达对大肠癌细胞株的体外细胞贴壁生长能力无明显影响,但减弱了细胞的非锚定依赖生长能力；ANGPTL4的表达促进了细胞的迁移能力,并表现出明显的伪足形成；ANGPTL4促进细胞迁移能力的提高通过上调细胞骨架蛋白相关蛋白ERM,VASP的表达促进了F-actin的聚合,同时下调E-Cadherin等细胞粘附分子的表达促进了细胞的迁移；结合肿瘤组织标本检测结果,我们认为随着肿瘤组织体积的增大,局部组织微环境的缺氧诱导了ANGPTL4的表达；而ANGPTL4的表达又可以进一步促进肿瘤的转移。