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芽孢杆菌β-甘露聚糖酶新基因的快速筛选、克隆及表达研究

2020-11-23阅读(303)

芽孢杆菌β-甘露聚糖酶新基因的快速筛选、克隆及表达研究

论文摘要

β-甘露聚糖酶（β-Mannanase）是一类能水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露多糖的内切水解酶,属于半纤维素酶类,主要来源于微生物,植物和低等动物中。β-甘露聚糖酶在造纸,食品,饲料,制药和石油开采等很多方面有重要的应用价值。微生物则是产β-甘露聚糖酶的重要来源,微生物来源的β-甘露聚糖酶具有产量高、易控制和成本低等优点。 芽孢杆菌是β-甘露聚糖酶的重要来源,具有较大的工业应用价值。本研究通过对核苷酸序列的比较,设计了一对简并引物,利用PCR技术,建立了一种快速的筛选芽孢杆菌新的β-甘露聚糖酶编码基因的方法。这种方法不仅可以快速评估所获得的基因片段的新颖性,而且通过反向PCR等方法可以克隆到基因的全长序列。利用此方法,从16株产β-甘露聚糖酶芽胞杆菌中,分别克隆了其β-甘露聚糖酶的部分基因片段。通过序列比对分析,其中两个基因片段同已发表的β-甘露聚糖酶基因相似性较低。通过反向PCR得到了两个基因的全长序列,分别命名为manB48和manB49。Genbank注册号为AY907668和AY913796。这两个基因同已发表的甘露聚糖酶基因序列的最高相似性分别为62.3%和62.4%。通过同源克隆获得另外一个β-甘露聚糖酶基因manB36,Genbank注册号为DQ351940。以上实验结果证实了这种快速筛选新基因方法的有效性。 来源于环形芽孢杆菌B48的甘露聚糖酶编码基因manB48在大肠杆菌和毕氏酵母中都得到了表达。通过亲和层析,纯化了在大肠杆菌中表达的融合蛋白MANB48E-H,并分析其酶学性质。MANB48E-H的最适pH和最适温度分别为7.6和58℃;有较好的pH稳定性,在pH6.8～9.0范围内酶活性维持在75%以上;MANB48的比活为481.55U/mg。 另一个来源于环形芽孢杆菌的新的甘露聚糖酶编码基因manB49同样在大肠杆菌和毕氏酵母中得到了表达。通过亲和层析,纯化了在大肠杆菌中表达的融合蛋白MANB49E-H。MANB49E-H的最适pH和最适温度分别为7.6和60℃;MANB49在pH6.0～10.0之间较稳定,剩余酶活性在75%以上,在pH11.0时,仍有28.68%的酶活性,这说明此酶具有很好的pH稳定性。MANB49E-H的比活为2276.81U/mg,是MANB48E-H比活的4.8倍。 从枯草芽孢杆菌B36培养液中纯化了β-甘露聚糖酶MANB36。MANB36的最适pH和最适温度分别为5.6和50℃。60℃下处理60分钟,MANB36保持了90%的酶活性;MANB36的比活为927.84U/mg。金属离子(除了Hg2+和Ag+),EDTA和2-ME对酶活性均无明显影响;MANB36对底物角豆胶有较高的特异性。 MANB36的编码基因manB36分别在大肠杆菌和毕氏酵母中得到表达,并纯化了酵母表达的融合蛋白MANB36P。MANB36P的最适pH和最适温度为6.2和42℃。同原酶相比,MANB36P的耐热性和pH稳定性均有所降低 本实验初步建立了一种新基冈的快速筛选方法,利用此方法筛选了三个β-甘露聚糖酶基因并做了进一步的研究。本实验为对新的β-甘露聚糖酶的研究提供了新的思路和经验。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  • 1.1 β-甘露聚糖酶的研究进展
  • 1.1.1 酶的来源及诱导
  • 1.1.2 酶来源菌的筛选
  • 1.1.3 酶的作用方式及水解产物
  • 1.1.4 酶的基本性质
  • 1.1.5 酶的分离纯化和活力测定
  • 1.1.6 酶的分类
  • 1.1.7 酶的分子生物学
  • 1.1.8 酶的应用
  • 1.2 研究的目的和意义
  • 第二章 芽孢杆菌β-甘露聚糖酶新基因的筛选
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 菌株与质粒
  • 2.1.2 引物合成
  • 2.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
  • 2.1.4 溶液
  • 2.1.5 培养基
  • 2.1.6 实验仪器
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 芽孢杆菌（Bacillus）β-甘露聚糖酶的平板筛选
  • 2.2.2 芽孢杆菌（Bacillus）的诱导产酶
  • 2.2.3 β-甘露聚糖酶的活性测定
  • 2.2.4 模板DNA的提取
  • 2.2.5 β-甘露聚糖酶基因部分序列的克隆
  • 2.2.6 DNA片段的回收和连接
  • 2.2.7 感受态细胞的制备
  • 2.2.8 电转化
  • 2.2.9 重组子筛选
  • 2.2.10 DAN测序
  • 2.2.11 芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因片段的相似性分析
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 产β-甘露聚糖酶的芽孢杆菌菌株的筛选
  • 2.3.2 β-甘露聚糖酶部分编码基因序列的克隆
  • 2.3.3 测得芽孢杆菌β-甘露聚糖酶编码基因序列相似性分析
  • 本章小结
  • 第三章 环形芽孢杆菌B48β-甘露聚糖酶基因的克隆，表达和酶的性质分析
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 菌株与质粒
  • 3.1.2 引物合成
  • 3.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
  • 3.1.4 主要仪器
  • 3.1.5 培养基配制
  • 3.1.6 有关试剂和溶液配制
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 基因克隆
  • +）的构建'>3.2.2 原核表达载体pET-22b-manB48E和pET-22b-manB48E-H（His-Tag+）的构建
  • 3.2.3 pET-22b-manB48E和pET-22b-man48E-H在大肠杆菌中的表达及检测
  • 3.2.4 真核表达载体pPIC9-manB48P的构建
  • 3.2.5 pPIC9-manB48P在毕赤酵母中的表达及检测
  • 3.2.6 大肠杆菌表达的β-甘露聚糖酶MANB48E-H纯化
  • 3.2.7 β-甘露聚糖酶MANB48E-H的酶学性质分析
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 基因克隆
  • 3.3.2 基因表达
  • 3.3.3 β-甘露聚糖酶MANB48E-H的纯化
  • 3.3.4 β-甘露聚糖酶MANB48-H的性质分析
  • 本章小结
  • 第四章 环形芽孢杆菌B49β-甘露聚糖酶基因的克隆，表达和酶的性质分析
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 菌株与质粒
  • 4.1.2 引物合成
  • 4.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
  • 4.1.4 主要仪器
  • 4.1.5 培养基配制
  • 4.1.6 有关试剂和溶液配制
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 基因克隆
  • +）的构建'>4.2.2 原核表达载体pET-22b-manB49E和pET-22b-manB49E-H（His-Tag+）的构建
  • 4.2.3 pET-22b-manB49E和pET-22b-man49E-H在大肠杆菌中的表达及检测
  • 4.2.4 真核表达载体pPIC9-manB49P的构建
  • 4.2.5 真核表达载体pPIC9-manB49P的表达及检测
  • 4.2.6 大肠杆菌表达的β-甘露聚糖酶MANB49E-H纯化
  • 4.2.7 β-甘露聚糖酶MANB49E-H的酶学性质分析
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 基因克隆
  • 4.3.2 基因表达
  • 4.3.3 β-甘露聚糖酶MANB49E-H的纯化
  • 4.3.4 β-甘露聚糖酶MANB49E-H的性质分析
  • 本章小结
  • 第五章 枯草芽孢杆菌B36β-甘露聚糖酶基因的克隆，表达和酶的性质分析
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 菌株与质粒
  • 5.1.2 引物合成
  • 5.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
  • 5.1.4 主要仪器
  • 5.1.5 培养基
  • 5.1.6 有关试剂和溶液配制
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 基因克隆
  • 5.2.2 原核表达载体pET-22b-manB36E的构建
  • 5.2.3 pET-22b-manB36E在大肠杆菌中的表达及检测
  • 5.2.4 真核表达载体pPIC9-manB36P的构建
  • 5.2.5 pET-22b-manB36P在毕赤酵母中的表达及检测
  • 5.2.6 β-甘露聚糖酶MANB36的纯化
  • 5.2.7 β-甘露聚糖酶MANB36转PVDF膜
  • 5.2.8 重组β-甘露聚糖酶MANB36P的纯化
  • 5.2.9 β-甘露聚糖酶MANB36和MANB36P的酶学性质分析
  • 5.3 结果与分析
  • 5.3.1 基因克隆
  • 5.3.2 基因表达
  • 5.3.3 蛋白纯化
  • 5.3.4 β-甘露聚糖酶MANB36的性质分析
  • 5.3.5 重组的β-甘露聚糖酶MANB36P的性质分析
  • 本章小结
  • 第六章 讨论
  • 6.1 关于β-甘露聚糖酶新基因的快速筛选
  • 6.2 反向PCR（IPCR）技术的应用
  • 6.3 克隆的β-甘露聚糖酶基因比较
  • 6.4 从大肠杆菌中纯化表达的β-甘露聚糖酶
  • 6.5 MANB48E-H和MANB49E-H的酶学性质
  • 6.6 MANB36和MANB36P的酶学性质
  • 6.7 纯化的四个β-甘露聚糖酶性质比较
  • 第七章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 相关论文文献

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