论文摘要
第一部分水通道蛋白家族与Kir 4.1在人星形细胞源性肿瘤中的表达目的:研究水通道蛋白家族（AQPs）与内向整流性钾通道4.1（Kir 4.1）在人星形细胞源性肿瘤和对照组脑组织的表达差异,以探讨星形细胞源性肿瘤发生及增殖的分子机制。方法:①所有星形细胞源性肿瘤标本取自重庆医科大学附属第一医院神经外科,重庆医科大学附属第二医院神经外科,第三军医大学西南医院神经外科,重庆市急救中心神经外科患者,共100例。以外伤后脑减压术的脑组织作为对照;②所有患者术前均行头部MRI检查;③所有标本自术中取出后,一部分用于病理检查,TUNEL检测及免疫组化实验,另一部分用于Western blot及RT-PCR实验;④应用免疫组化技术,检测肿瘤组织与对照组组织中AQPs（AQP35、8、9）以及Kir 4.1的表达情况;⑤应用Western blot技术,检测肿瘤组织与对照组组织中AQPs（AQP35、8、9）以及Kir 4.1蛋白的表达情况;⑥应用RT-PCR技术,检测肿瘤组织与对照组组织中AQPs（AQP35、8、9）以及Kir 4.1 mRNA的表达情况;⑦利用相关的统计软件对实验结果进行统计分析。结果:①MRI发现星形细胞源性肿瘤患者以病灶以额叶和颞叶均多;②按照世界卫生组织（WHO）2000年修正分类、分级,其中WHOⅣ25例,WHOⅢ27例,WHOⅡ29例,WHOⅠ19例;③TUNEL检测发现凋亡指数随着病理等级的增加而下降（ P<0.05 ）;④不同星形细胞源性肿瘤组织与对照组相比较,Kir 4.1表达增强（ P<0.05 ）;Kir 4.1的表达与星形细胞源性肿瘤WHO病理等级相关,随着病理等级的增加,Kir 4.1的表达增强（ P<0.05 ）;⑤不同星形细胞源性肿瘤组织与对照组相比较,AQP9表达增强（ P<0.05 ）;AQP9的表达与星形细胞源性肿瘤WHO病理等级相关,随着病理等级的增加,AQP9的表达增强（ P<0.05 ）;⑥肿瘤组组织与对照组脑组织相比较,WHOⅢⅣ组AQP4表达明显增强,差异有统计学意义（P<0.05）;而WHOⅠⅡ组AQP4表达减弱,差异有统计学意义（P<0.05）。肿瘤组之间比较,WHOⅢⅣ组AQP4表达较为强烈,WHOⅠⅡ组相对较弱。差异有统计学意义（P<0.05）;⑦肿瘤组组织与对照组脑组织相比较,AQP3与AQP5的表达增强,差异有统计学意义（P<0.05）;但不同等级的肿瘤之间比较,AQP3与AQP5的表达无统计学差异（P>0.05）;⑧不同星形细胞源性肿瘤组织与对照组相比较,AQP8的表达无明显差异（P>0.05）。结论:本实验结果表明:①Kir 4.1表达的变化与人星形细胞源性肿瘤WHO病理等级相关。Kir 4.1可能为星形细胞源性肿瘤形成的新的生物标记物或者药物治疗靶点之一。人星形细胞源性肿瘤Kir 4.1表达增强,可能是其增殖、生长的重要的分子生物学机制之一。②AQP9表达的变化与人星形细胞源性肿瘤WHO病理等级相关。AQP9可能为星形细胞源性肿瘤形成的新的生物标记物或者药物治疗靶点之一。人星形细胞源性肿瘤AQP9表达增强,可能是其增殖、生长的重要的分子生物学机制之一。③在WHOⅢⅣ级的星形细胞源性肿瘤中,AQP4的表达比对照组脑组织强。然而,在WHOⅠⅡ级的星形细胞源性肿瘤中,AQP4的表达比正常脑组织还要弱。我们认为这一现象提示在WHOⅠⅡ级的星形细胞源性肿瘤水的转运过程中,AQP4不是主要的转运途径。④AQP3与AQP5在肿瘤组织中表达增强,提示以上两者可能在肿瘤组织水的转运过程中起了重要作用;但为何不同病理等级的肿瘤AQP3与AQP5表达无明显差异,还需要我们作进一步的研究。⑤不同星形细胞源性肿瘤与对照组相比较,AQP8的表达无明显差异。AQP8是否与星形细胞源性肿瘤的增殖、生长相关,还需要进一步的研究证实。第二部分水通道蛋白家族与Kir 4.1在大鼠C6胶质肿瘤细胞周期中的表达目的:研究水通道蛋白家族（AQPs）与内向整流性钾通道4.1（Kir 4.1）在大鼠C6胶质肿瘤细胞增殖周期中的表达差异,以探讨胶质肿瘤发生及增殖的分子机制。方法:①培养C6胶质肿瘤细胞,以星形胶质细胞作为对照;②利用细胞同步化技术使C6细胞与星形胶质细胞分为G0/G1期的细胞,S期细胞,G2/M期细胞三组,应用流式细胞仪检测同步化效果;③透射电镜观察C6细胞超微结构变化;④应用免疫荧光技术,检测各组细胞的AQPs（AQP35、8、9）以及Kir 4.1的表达情况,并检测AQP4与Kir 4.1的共表达;⑤应用Western blot技术,检测各组细胞的AQPs（AQP35、8、9）以及Kir 4.1蛋白的表达情况;⑥利用相关的统计软件对实验结果进行统计分析。结果:①细胞同步化后可以分别得到80.20%的S期为主的C6细胞,65.36%的G2/M期C6细胞和92.47%的G0/G1期C6细胞;可以分别得到78.57%的S期为主的星形胶质细胞,62.10%的G2/M期星形胶质细胞和90.37%的G0/G1期星形胶质细胞。达到我们实验对细胞的要求;②C6胶质瘤细胞形态不规则,内质网增生活跃,胞浆丰富,染色质边集,线粒体肿胀,核形不规则;③AQP3、5、8、9在星形胶质细胞与C6胶质肿瘤细胞的G0/G1期表达最强烈,而在S期,G2/M期表达较弱（P<0.05）,在S期与G2/M期的表达无明显差异（P>0.05）。星形胶质细胞与C6细胞互相比较,AQP3、5、9在C6细胞各细胞周期中表达较强（P<0.05）,AQP8在星形胶质细胞与C6细胞各细胞周期中表达无明显差异（P>0.05）;④AQP4在星形胶质细胞与C6细胞的G0/G1期表达,在S期,G2/M期未发现明显表达。星形胶质细胞与C6细胞互相比较,AQP4在G0/G1期的C6细胞中表达较强（P<0.05）;⑤Kir 4.1在星形胶质细胞与C6细胞的G0/G1期表达最强烈,在G2/M期表达较为强烈,在S期表达比较弱（P<0.05）。星形胶质细胞与C6细胞互相比较, Kir 4.1在G0/G1期的C6细胞中表达较强; Kir 4.1在G2/M期的星形胶质细胞中表达较强（P<0.05）; Kir 4.1在星形胶质细胞与C6细胞S期中的表达无明显差异（P>0.05）。⑥相对于G0/G1期的星形胶质细胞,Kir 4.1与AQP4在C6细胞G0/G1期中的共表达较强。统计学分析后,发现在C6细胞中的Kir 4.1/AQP4的比值大于其在星形胶质细胞中的比值（P<0.05）;结论:本实验结果表明:①星形胶质细胞与C6细胞中的AQP3、5、8、9有可能在细胞增殖周期中的G0/G1期发挥了重要作用,AQP3、5、9可能在C6星形胶质肿瘤细胞水转运中占有重要的作用;AQP8可能在C6星形胶质肿瘤细胞水的转运中并非占主导作用;②AQP4的表达是细胞周期依赖的,无论是星形胶质细胞,还是C6胶质瘤细胞都仅表达于细胞增殖周期的G0/G1期。但C6胶质肿瘤细胞中AQP4的表达强于其在星形胶质细胞中的表达,提示AQP4可能在C6星形胶质肿瘤细胞水转运中占有非常重要的作用;③Kir 4.1有可能在C6胶质瘤细胞增殖周期中的G0/G1期发挥了重要作用,而且Kir 4.1有可能使G2/M期的C6细胞中向G0/G1期转换,但其机制需要进一步的研究;④Kir 4.1与AQP4在C6细胞中表达增强,但Kir 4.1表达增强的幅度较大,提示Kir 4.1与AQP4可能在功能上失偶联,但还需要作进一步的研究;第三部分水通道蛋白家族与Kir 4.1在大鼠C6胶质肿瘤增殖过程中的表达目的:研究水通道蛋白家族（AQPs）与内向整流性钾通道4.1（Kir 4.1）在大鼠C6胶质肿瘤增殖过程中的表达,以探讨胶质肿瘤发生及增殖的分子机制。方法:①将120只Wistar大鼠随机分成A、B、C、D四组,A（建模后1周）、B（建模后2周）、C（建模后3周）三组作为实验组,D组作为实验对照组;②立体定向建立大鼠脑深部C6胶质瘤模型,观察立体定向颅内右侧尾状核接种C6胶质瘤细胞后1周、2周、3周大鼠及对照组大鼠的临床表现;③观察各实验组大鼠的MRI影像学表现;④观察各实验组大鼠的脑组织含水量的变化;⑤利用HE染色、GFAP免疫组化检测对移植瘤的病理特性进行观察;⑥应用免疫组化技术,检测各实验组大鼠的AQPs（AQP35、8、9）以及Kir 4.1表达情况;⑦应用Western blot技术,检测各实验组大鼠的AQPs（AQP35、8、9）以及Kir 4.1蛋白的表达情况;⑧应用RT-PCR技术,检测各实验组大鼠的AQPs（AQP35、8、9）以及Kir 4.1 mRNA的表达情况;⑨利用相关的统计软件对实验结果进行统计分析。结果:①立体定向颅内种植C6胶质瘤细胞后,荷瘤鼠的明显症状出现于第2周,2-3周内症状明显加重;②MRI及组织病理学观察移植肿瘤成功79只,MRI显示肿瘤直径在A、B、C组不断增加,瘤体随着瘤龄的延长其体积明显增大（P<0.05）;③脑组织含水量随肿瘤的生长明显加重（P<0.01）;④肿瘤组组织（A、B、C组）分别与对照组脑组织（D组）相比较,Kir 4.1、AQP3、AQP4、AQP5与AQP9蛋白及其mRNA在肿瘤组织中的表达强于正常脑组织（P<0.05）,AQP8蛋白及其mRNA在肿瘤组织中的表达与正常脑组织无明显差异（P>0.05）;⑤肿瘤组组织相互比较,Kir 4.1、AQP4、AQP9蛋白及其mRNA在C组中表达最强,在B组中表达较强,在A组中表达最弱,差异有统计学意义（P<0.05）; AQP3、AQP5、AQP8蛋白及其mRNA在A、B、C组中表达无明显差异（P>0.05）。结论:本实验结果表明:①立体定向建立大鼠C6胶质瘤模型的成功率高,接种后肿瘤呈浸润性生长,能模拟人脑胶质瘤的特性;②Kir 4.1、AQP3、AQP4、AQP5与AQP9在肿瘤组织中的表达强于正常脑组织,提示以上几种通道可能在C6胶质肿瘤组织水的转运过程中起了重要作用;③Kir 4.1、AQP4、AQP9随着C6胶质肿瘤在大鼠颅内的增殖生长而表达增强,提示以上三者的表达变化可能是C6胶质肿瘤增殖、生长的重要的分子生物学机制之一;④各个时段的肿瘤组织与对照组组织之间相互比较,AQP8的表达无明显变化,提示AQP8是否与C6胶质肿瘤的水转运及增殖、生长相关,还需要进一步的研究证实。
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