小麦受条锈菌侵染后防卫基因的表达特征及其克隆

小麦受条锈菌侵染后防卫基因的表达特征及其克隆

论文题目: 小麦受条锈菌侵染后防卫基因的表达特征及其克隆

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 崔素萍

导师: 康振生

关键词: 病原寄主互作,防卫基因,表达,克隆

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 小麦条锈病是世界范围内小麦上最重要的病害之一。国内外研究和生产实践证明,种植抗锈品种是控制该病害最经济、有效、易行和对环境安全的核心措施。小麦抗锈性机制的研究是选育抗病品种的基础。人们已从形态学、组织学、细胞学、生理生化等方面对小麦与锈菌的互作进行了许多研究,在不同层次、不同水平上认识了小麦的抗锈性。但关于小麦抗条锈的分子机制目前仍了解甚少,为此,本研究首次系统研究了小麦与小麦条锈菌互作关系中防卫基因在转录水平上的表达特征。为了揭示小麦受条锈菌侵染后防卫反应过程中病程相关蛋白PR-1、PR-2(?-1,3-glucanase)、PR-3(chitinase)、PR-5(thaumatin)等基因在转录水平上在非亲和组合、亲和组合和未接种对照中的表达特征,以明确防卫基因的表达和累积特征与寄主抗条锈性的关系,本研究利用Northern 杂交的方法,对小麦受条锈菌侵染后不同时期的非亲和组合、亲和组合和对照中的小麦叶片总RNA进行杂交;同时利用PR-2(?-1,3-glucanase)基因的保守区设计一对PCR引物,经RACE 反应扩增得到小麦叶片中的一条新的全长cDNA,通过Northern 杂交来明确该基因在小麦与条锈菌互作关系中的不同组合中的表达情况,为进一步揭示小麦抗条锈性的分子机理,开展小麦抗锈性的遗传工程提供理论基础。本论文研究结果如下: 1. 摸索出了一种适合于提取小麦叶片总RNA 的简单快速方法。此方法提取的小麦叶片总RNA 的完整性好,纯度高适合于富含多糖和脂质的植物组织的总RNA的提取,可用于RT-PCR、RACE、Northern杂交等后续操作。2. 小麦受条锈菌侵染后不同组合中PR-1、PR-2(?-1,3-glucanase)、PR-3(chitinase)、PR-5(thaumatin) 四种防卫基因在转录水平的表达情况如下: (1) 受条锈菌侵染后小麦叶片中病程相关蛋白PR-1 防卫基因的表达情况:在非亲和组合中,接种后24 h开始表达,48 h出现表达高峰,30-48 h表达量比较高,侵染后期仍有表达。在亲和组合中,接种后42 h开始表达。在亲和组合中被激活的时间要迟于非亲和组合, 亲和组合中的各时期的表达量低于非亲和组合。(2) 受条锈菌侵染后小麦叶片中病程相关蛋白PR-2(?-1,3-glucanase) 防卫基因的表达情况:在非亲和组合中,接种后18 h开始表达,在侵染初期, 接种后30 h表达量比较高,侵染后期的表达量高于侵染初期。在亲和组合中的表达模式与非亲和组合相同,但

论文目录:

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英文摘要

第一章 文献综述

1 小麦条锈病

1.1 小麦条锈病的起源与分布

1.2 小麦条锈病的研究现状

2 植物抗病的分子生物学研究

2.1 植物抗病机制

2.2 植物抗病基因的类型、结构与功能

2.2.1 植物抗病基因的类型

2.2.2 植物抗病基因的结构与功能

2.3 植物抗病基因克隆的方法

2.3.1 图位克隆法

2.3.2 转座子标签法(Transposon tagging)

2.3.3 抗病基因同源序列法

2.3.4 mRNA差异显示

2.4 植物防卫基因

2.4.1 植物防卫基因

2.4.2 已克隆的防卫反应基因

2.4.3 防卫反应基因的结构特点

2.4.4 防卫反应基因的表达,调控

3 病程相关蛋白与植物抗病性的研究进展

3.1 几丁质酶与植物的抗病性

3.2 β-1,3-葡聚糖酶与植物的抗病性

3.2.1 β-1,3-葡聚糖酶在体外的抑菌作用

3.2.2 β-1,3-葡聚糖酶的诱导及其活性与植物的抗病性

3.2.3 转入β-1,3-葡聚糖酶基因植物的抗病性

3.2.4 β-1,3-葡聚糖酶与几丁质酶的协同性

4 本研究的目的意义

第二章 小麦叶片总RNA的提取

1 材料与方法

1.1 生化试剂

1.2 实验仪器

1.3 供试小麦品种及材料准备

1.4 小麦叶片总RNA 的提取与纯化

1.4.1 小麦叶片总RNA 的提取

1.4.2 小麦叶片总RNA 的纯化

1.4.3 小麦叶片总RNA 的纯度测定

1.4.4 小麦叶片总RNA 的完整性检测

2 结果与分析

2.1 总RNA 的完整性及纯度检测

2.1.1 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.1.2 甲醛变性电泳检测结果

3 结论与讨论

第三章 小麦受条锈菌侵染后防卫基因的表达特征

1 材料与方法

1.1 仪器

1.2 试剂

1.3 供试菌种和小麦品种

1.4 接种和培养

1.5 取样及取样量

1.6 取样时间

1.7 不同组合和不同取样时间小麦叶片总RNA 的提取

1.8 Northern blotting 分析

1.8.1 cDNA 杂交探针的制备

1.8.2 探针的回收

1.8.3 RNA 甲醛变性电泳

1.8.4 RNA 印迹转移

1.8.5 杂交

1.8.6 洗膜

1.8.7 杂交显色

2 结果与分析

2.1 cDNA 杂交探针的检测结果

2.2 Northern 杂交结果

2.2.1 受条锈菌侵染后小麦叶片中PR-1(PR-1homologue)防卫基因在转录水平上的表达特征

2.2.2 受条锈菌侵染后小麦叶片中PR-2(β-1,3-glucanase)防卫基因在转录水平上的表达特征

2.2.3 受条锈菌侵染后小麦叶片中PR-3(chitinase)防卫基因在转录水平上的表达特征

2.2.4 受条锈菌侵染后小麦叶片中PR-5(thaumatin)防卫基因在转录水平上的表达特征

3 结论与讨论

第四章 β-1,3-葡聚糖酶基因全长CDNA的克隆及其表达特征

1 材料与方法

1.1 用于全长cDNA 克隆的小麦材料

1.2 生化试剂

1.3 菌株

1.4 材料准备

1.5 小麦叶片总RNA 的提取

1.6 RT-PCR 克隆-β1,3-葡聚糖酶基因

1.6.1 第一链cDNA 的合成

1.6.2 RT-PCR 扩增β-1,3-葡聚糖酶基因

1.6.3 PCR 扩增产物的回收

1.6.4 PCR 产物的载体连接反应

1.6.5 感受态细胞的制备及连接产物的转化

1.6.6 重组质粒的筛选与鉴定

1.6.7 cDNA 片段的测序及序列分析

1.7 全长cDNA 的克隆

1.7.1 5’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 与3’RACE 特异引物设计

1.7.2 3’RACE

1.7.3 5’RACE

1.7.4 RACE产物克隆测序及序列分析

1.8 全长cDNA 的Northern 杂交分析

1.8.1 试剂

1.8.2 小麦材料的准备及总RNA 的提取

1.8.3 Northern 杂交方法

2 结果与分析

2.1 RT-PCR 扩增-β1,3-葡聚糖酶基因

2.2 cDNA 片段的核酸序列分析

2.3 5’RACE 与3’RACE

2.4 全长cDNA 序列及序列分析

2.5 核酸序列分析及推导的氨基酸序列分析

2.6 全长cDNA DQ090946 的Northern 杂交

3 结论与讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

  • [1].小麦与条锈菌互作机理研究及抗条锈相关基因的功能分析[D]. 王晓杰.西北农林科技大学2009
  • [2].小麦与条锈菌互作过程中活性氧迸发的组织学和细胞化学研究[D]. 王晨芳.西北农林科技大学2008
  • [3].条锈菌与小麦互作中效应蛋白及诱导寄主细胞坏死基因的鉴定与功能分析[D]. 汤春蕾.西北农林科技大学2013
  • [4].小麦与条锈菌互作过程中活性氧和防御基因的防御反应及抗病相关基因的鉴定与功能验证[D]. 王晓敏.西北农林科技大学2010
  • [5].小麦条锈菌致病相关基因鉴定及其功能研究[D]. 成玉林.西北农林科技大学2015
  • [6].条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因的表达特征分析及条锈菌基因功能验证体系建立的探索[D]. 刘博.西北农林科技大学2010
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