藏酋猴线粒体基因组序列测定与进化分析

论文摘要

本实验采用PCR扩增和基因克隆等常规分子生物学手段,并结合生物信息学方法对藏酋猴部分线粒体基因组序列进行测定与分析,获得藏酋猴线粒体基因中部分基因组序列,结合GenBank中获得的跗猴、猕猴、川金丝猴、白掌长臂猿、苏门达腊猩猩、黑猩猩、大猩猩、人等8种灵长类动物线粒体基因中的同源序列,确定藏酋猴线粒体基因组中部分基因序列与其他灵长类同源序列的核苷酸同源性高低,计算藏酋猴线粒体基因组中部分基因序列与其他灵长类同源序列的遗传距离,用最大简约法构建系统进化树,进行灵长类动物的分子系统进化研究。主要结果如下:1)通过PCR扩增,采用直接测序或克隆测序方法共得到4个片段,总长为5223 bp的藏酋猴线粒体基因组序列。2)所获得序列包括部分D-loop、12S rRNA、COⅠ、COⅡ、COⅢ、Cyt b基因、完整的ATP6、ATP8基因以及tRNA-Phe、tRNA-Ser、tRNA-Asp、tRNA-Lys、tRNA-Thr、tRNA-Pro等6个tRNA基因。所测4个片段中,4种碱基的比例范围如下:C:24.26-32.22%,G:11.79-15.65%,A:26.76-35.15%,T:23.38-30.37%,G+C含量均低于A+T的含量。3)所获得的线粒体基因组序列中,其中完整的ATP6基因和ATP8基因的编码阅读框分别为681 bp和207 bp,分别编码227个和69个氨基酸,起始密码子均为ATG,终止密码子为TAA,藏酋猴ATP6的起始密码子与其他灵长类动物的起始密码相同,藏酋猴线粒体ATP8基因终止密码子与猕猴和川金丝猴的ATP8基因终止密码子相同,但与其他7种灵长类的终止密码子（TAG）不同。藏酋猴线粒体ATP6基因的起始区域和ATP8基因的终止区域有46bp的重叠。4)从本试验测序结果中选取12S rRNA基因、COⅠ基因、ATP6基因和ATP8基因与其他灵长类动物进行核苷酸同源性分析,并计算各物种之间的遗传距离。结果显示:在这9种动物中,藏酋猴与猕猴线粒体ATP6基因的遗传距离最近,藏酋猴与跗猴线粒体ATP6基因的遗传距离最远;藏酋猴与猕猴的核苷酸同源性最高,藏酋猴与跗猴的核苷酸同源性最低。5)利用试验测得的藏酋猴线粒体基因中12S rRNA基因、COⅠ基因、ATP6基因和ATP8基因序列,结合GenBank中其他灵长类动物线粒体的同源基因序列,按最大简约法构建灵长类动物系统进化树。结果显示:基于12S rRNA基因、COⅠ基因和ATP6基因构建的系统进化树完全相同,藏酋猴和猕猴聚为一个分支,黑猩猩和大猩猩在不同分支中,而基于ATP8基因构建的系统进化树中,黑猩猩与大猩猩聚为一个分支,该结果与前三者略有不同。在12S rRNA、COⅠ和ATP6和ATP8基因系统进化树中,藏酋猴与猕猴、川金丝猴等旧大陆猴的亲缘关系较近,藏酋猴与跗猴等原猴的亲缘关系较远。这与前人以其它分子标记所作的研究结果一致。比较基于12S rRNA基因、COⅠ基因、ATP6基因和ATP8基因构建的系统进化树,结合灵长类动物分类结果、核昔酸同源性和遗传距离比较结果,可以看出藏酋猴线粒体基因中12S rRNA基因、COⅠ基因、ATP6基因比ATP8基因更适宜进行系统进化分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 动物线粒体基因组结构特点
• 1.2 动物线粒体基因组的结构及基因组分
• 1.2.1 蛋白质编码基因
• 1.2.2 tRNA基因
• 1.2.3 rRNA基因
• 1.2.4 非编码区
• 1.2.5 潜在的开放阅读框
• 1.3 线粒体基因组分子系统研究
• 1.3.1 分子系统树的构建
• 1.3.2 线粒体DNA的分子系统学进化研究
• 1.4 线粒体DNA进化遗传学研究趋势
• 1.4.1 研究物种间的系统进化
• 1.4.2 利用mtDNA的种内多态性研究母系演化
• 1.4.3 检测自然界的杂交渐渗现象
• 1.4.4 追踪特异物种的生活史
• 1.5 线粒体DNA与灵长类分子系统进化研究概况
• 1.5.1 基于蛋白质编码基因和tRNA基因研究系统进化
• 1.5.2 基于rRNA基因研究系统进化
• 1.5.3 基于非编码区研究系统进化
• 1.6 藏酋猴的生物学特性及其用途
• 1.7 小结
• 1.8 本论文研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 材料来源
• 2.1.2 主要设备
• 2.1.3 主要试剂及其配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 哺乳动物总DNA的提取与检测
• 2.2.2 藏酋猴线粒体基因PCR的扩增与测序
• 2.2.3 藏酋猴线粒体基因的克隆
• 2.2.4 测序
• 2.2.5 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 藏酋猴总DNA提取
• 3.2 PCR扩增产物与纯化
• 3.2.1 MT DIF和MT DIR引物的PCR扩增结果
• 3.2.2 MT SCF和MT SCR引物的PCR扩增结果
• 3.2.3 MT C12F和MT C12R引物的PCR扩增结果
• 3.2.4 MT AC3F和MT AC3R引物的PCR扩增结果
• 3.2.5 MT CN4F和MT CN4R引物的PCR扩增结果
• 3.2.6 MT NCbF和MT NCbR引物的PCR扩增结果
• 3.2.7 MT CbF和MT CbR引物的PCR扩增结果
• 3.3 藏酋猴线粒体基因克隆结果
• 3.4 藏酋猴线粒体DNA序列测定
• 3.4.1 MT D1 PCR扩增产物测序结果
• 3.4.2 MT C12克隆测序结果
• 3.4.3 MT AC3克隆测序结果
• 3.4.4 MT Cb PCR扩增产物测序结果
• 3.5 物种间同源性及遗传距离比较分析
• 3.5.1 基于12SrRNA基因的核苷酸同源性和遗传距离比较
• 3.5.2 基于COI基因的核苷酸同源性和遗传距离比较
• 3.5.3 基于ATP6基因的核苷酸同源性和遗传距离比较
• 3.5.4 基于ATP8基因的核苷酸同源性和遗传距离比较
• 4 讨论
• 4.1 引物的设计
• 4.2 PCR试验条件的优化
• 4.2.1 模板的完整性、浓度、纯度、对扩增产物的影响
• 4.2.2 聚合酶对扩增产物的影响
• 4.2.3 变性温度对扩增产物的影响
• 4.2.4 退火温度
• 4.2.5 降落PCR
• 4.3 PCR扩增结果及序列测定
• 4.4 基因克隆及序列测定
• 4.5 物种间同源性及遗传距离比较
• 4.6 藏酋猴系统进化分析
• 5、结论
• 参考文献
• 致谢