论文摘要
移植排斥一直是自移植诞生以来最大的学术难题,制约着移植的发展,每次抗排斥的进步,都极大地推动移植医学的前进。在目前器官移植排斥的临床治疗中,已有的高效免疫抑制剂的应用虽然可有效地控制急性免疫排斥反应,但对超急性排斥及慢性排斥的治疗效果不佳,且终身使用免疫抑制剂药物可引起的骨髓抑制、肿瘤、感染、移植器官功能慢性丧失等不良反应,以及药物自身的毒副作用和高昂费用等问题。自Medawar提出移植免疫耐受的概念以来,免疫耐受一直是器官移植追求的终极目标。所谓免疫耐受,是指在不应用免疫抑制剂的情况下,机体免疫系统对同种异型移植抗原产生特异性的无应答,而对其它抗原或病菌保持正常的防御功能。机体维持自身免疫耐受的主要机制包括中枢耐受和外周耐受,前者主要为中枢免疫器官中发生的细胞克隆清除;后者包括克隆缺失、克隆失活、免疫忽视以及免疫抑制。免疫抑制是通过免疫抑制剂对T、B淋巴细胞的活化、分化和增殖的抑制以及诱导调节性T细胞的负向调节发挥抑制免疫系统的作用。Treg细胞是一类不同于Th1和Th2的具有免疫调节功能的T细胞亚群,具有免疫调节或免疫抑制功能,主要通过两种机制发挥免疫抑制效应:（1）细胞接触发挥抑制:Treg细胞活化后其膜表面的TGF-β与靶细胞表面的TGF-β受体结合,抑制效应T细胞的活化与增殖以及树突状细胞的成熟;同时,其表面表达的CTLA-4也可通过与CD80、CD86的结合来发挥抑制作用;（2）分泌细胞因子介导抑制:Treg细胞释放IL-10、TGF-β等细胞因子,抑制APC的抗原提呈和效应性T细胞的活化。Treg细胞来自胸腺中定向分化的T细胞,但在一定条件下,也可由外周静息T细胞分化而来。转录因子Foxp3基因参与Treg细胞的中枢性和外周性生成过程,并影响Treg细胞免疫调节功能的发挥。排斥或耐受取决于效应性T细胞和Treg细胞之间的平衡。长期以来,免疫抑制的治疗主要目的在于打击受体的免疫系统,抑制机体的免疫状态,CsA等抑制药物虽可抑制排斥反应发作,但同时也可能抑制了被认为与移植物长期接受密切相关的Treg细胞生成,有可能阻断了移植术后机体免疫耐受的自发形成。动物实验表明,在没有应用免疫抑制剂的情况下,移植物可以被受体接受;而这些模型在应用某些大剂量免疫抑制剂后,受体对移植物的免疫耐受却被阻断。寻找在抑制排斥反应的同时,又不抑制Treg细胞生成,不阻止移植术后机体免疫耐受的形成便成为新的研究方向。本研究分析临床常用的免疫抑制剂CsA和Rapa在体内体外对CD4+CD25+T细胞的增殖和Treg细胞转录因子Foxp3的表达的作用,进而影响可能的免疫耐受,为指导临床用药,从而提高器官移植物存活期提供依据和思路。第一部分:雷帕霉素对小鼠调节性T细胞体外分化和增殖的影响的实验研究目的:通过观察雷帕霉素或环孢霉素A与CD4+T细胞体外共培养对CD4+CD25+Treg细胞增殖情况,对Foxp3的表达的影响,探讨雷帕霉素诱导免疫耐受的可能性及其机制。方法:无菌条件下取C57BL/6小鼠脾脏,分离单个核细胞,免疫磁珠阴性分选获得CD4+T细胞,设空白对照组、雷帕霉素组、环孢霉素组与抗CD3单抗,抗CD28单抗和IL-2共培养7d。上流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞。半定量RT-PCR检测Foxp3mRNA表达水平。结果:与对照组比较,环孢组CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞比例明显降低（3.72%vs7.42%,p＜0.01）;雷帕组CD4+CD25+Treg细胞占CD4+ T细胞比例明显升高（11.47%vs 7.42%,p＜0.01）;雷帕组T细胞Foxp3 mRNA表达明显高于环孢组（P＜0.01）,明显高于对照组（P＜0.01）;环孢组Foxp3 mRNA表达与对照组比较明显较低（P＜0.05）。结论:雷帕霉素在体外培养促进CD4+CD25+Treg细胞的增殖与生长,而环孢霉素A体外抑制CD4+CD25+Treg细胞的增值与生长;体外实验Foxp3与CD4+CD25+Treg细胞呈正相关。第二部分雷帕霉素对小鼠心脏移植模型调节性T细胞增殖的影响的实验研究目的:通过观察雷帕霉素或环孢霉素A对小鼠异位心脏移植术后心脏生存时间、脾脏CD4+CD25+Treg细胞增值情况和Foxp3的表达的影响,探讨雷帕霉素诱导免疫耐受的可能性及其机制。方法:应用Cuff法建立雄性BALB/C→C57BL/10小鼠颈部异位心脏移植模型,根据术后用药情况,受体分为3组（n=10）;对照组（术后不用药）、雷帕霉素治疗组、环孢霉素A治疗组。记录移植心脏生存时间,于移植心停搏或术后14d取脾,分离单个核细胞,上流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞。半定量RT-PCR检测Foxp3mRNA表达水平。结果:与对照组比较,环孢组和雷帕组均明显提高移植心脏的生存时间（p＜0.01）,而两者之间则无明显差别（p＞0.05）;与对照组比较,环孢组CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞比例明显降低（3.80%vs7.24%,p＜0.01）;雷帕组CD4+CD25+Treg细胞占CD4+ T细胞比例明显升高（12.07%vs 7.24%,p＜0.01）;雷帕组T细胞Foxp3 mRNA表达明显高于环孢组（P＜0.01）,明显高于对照组（P＜0.01）;环孢组Foxp3 mRNA表达与对照组比较明显较低（P＜0.01）。结论:小鼠心脏移植后使用雷帕霉素或环孢霉素A均明显提高了移植心脏的生存期,两者之间对生存期的影响没有明显差距;雷帕霉素在体内促进CD4+CD25+Treg细胞的增值与生长,而环孢霉素A体内抑制CD4+CD25+Treg细胞的增值与生长;体内实验Foxp3与CD4+CD25+Treg细胞呈正相关。
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