论文摘要
维生素B12是一种哺乳动物所必需的维生素，具有广泛的生理学作用，但是哺乳动物自身却不能合成，仅有某些特定的微生物才能合成维生素B12如杆菌，沙门氏菌，丙酸菌和假单胞菌。目前，工业上主要利用脱氮假单胞菌和费氏丙酸杆菌进行维生素B12的生产。由于费氏丙酸杆菌不产生任何毒素，被美国FDA认定为GRAS（Generlly reagard as safe），其发酵过程能耗低，染菌概率小。因此，费氏丙酸杆菌在维生素B12的发酵生产上占据了越来越重要的地位。为了详尽代谢过程，阐明合成途径，迄今为止，人们已经获得了大部分费氏丙酸杆菌维生素B12生物合成相关的基因，但是，应用费氏丙酸杆菌发酵生产维生素B12的生物合成途径仍不明确。本研究以费氏丙酸杆菌为出发菌株，克隆、解析了与维生素B12生物合成相关的部分基因。首先，应用遗传互补法，将费氏丙酸杆菌IFO12424株的染色体基因文库，电击转化到Salmonella typhimurium CobⅢ领域的缺失突变株TT10858中，进行p．freudenreichi CobⅢ领域维生素B12生物合成基因的筛选，结果得到了4206bp的DNA片段，命名为P4。解析结果表明，该片段包含了一个部分的和三个完整的读写框，依次为编码L-苏氨酸-O-3-磷酸盐脱羧酶的cobD，编码腺苷钴啉酰胺（AdoCbi）激酶和AdoCbi-P鸟苷酸转移酶的cobU，负责催化AdoCbi-GDP与α-ribazole连接，完成腺苷钴胺素（AdoCbI）最终合成的cobS，及编码转录调节蛋白的cobR。然后，根据所得cobD的碱基序列，设计相应引物，应用LA PCRTM in vitro Cloning Kit，获得了cobD上游3290bp的序列信息，命名为P3。经序列分析，发现此片段包含了编码钴啉酸a，c-二酰胺合成酶的cbiA、负责传递腺苷将钴啉胺酸a，c-二酰胺转化生成腺苷钴啉胺酸a，c-二酰胺的cobA，催化腺苷钴啉胺酸a，c-二酰胺酰胺化生成腺苷钴啉胺酸的cbiP以及cobD的上游区域。最后，将两者合并后得到全长为7308bp的DNA片段，命名为P7。经ORF检索和同源性分析，发现此片段包含了一个部分ORF和5个完整的ORF，依次为cbiP，cobA，cbiA（cbiA-cobD），cobU，cobS和cobR，它们编码的蛋白负责催化费氏丙酸杆菌发酵生产维生素B12过程中，从钴啉胺酸a，c-二酰胺到最终AdoCbI的生成。因此，发现这些基因为探索费氏丙酸杆菌维生素B12的生物合成途经将具有一定的理论意义。