论文摘要
研究背景和目的:大肠癌（Colorectal cancer,CRC）是常见的恶性肿瘤之一。近年来,我国大肠癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势,侵袭和转移是导致其死亡的主要原因。肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤、多基因共同作用的复杂过程。肿瘤细胞和宿主之间的相互作用是肿瘤发生发展的内在因素,肿瘤细胞转移具有一定的器官倾向性,这可能是瘤细胞与特定的器官微环境相互作用的结果。肿瘤转移取决于肿瘤细胞本身的分子特性和其分泌的因子对周围间质细胞的影响,包括血管、结缔组织和免疫细胞等。特殊的肿瘤微环境通过各种调节机制影响着肿瘤细胞的生长发展和侵袭转移。因此,肿瘤转移不只是肿瘤细胞本身的生物学特性及遗传特性所决定,从根本上说是癌细胞与宿主相互作用的结果,宿主甚至起决定性作用。造血祖细胞（hematopoietic progenitor cell）是造血组织具有自我复制和分化潜能的原始细胞。最初CD34+抗原被认为是造血祖细胞的重要标志,该抗原在原始造血细胞表达旺盛,后随细胞分化而逐渐减弱。对祖细胞表面标志性抗原的初步研究发现,CD133+细胞较CD34+细胞具有更强的增殖潜能且包含有更高比例的长期培养起始细胞,在正常骨髓微环境条件下CD133+细胞可能比CD34+细胞具有更强的趋化和迁移能力,CD133+造血祖细胞可能代表了更原始的造血细胞。2005年Kaplan RN发现了VEGFR1阳性造血祖细胞（vascular endothelialgrowth factor receptor 1 positive hematopoietic progenitor cell,VEGFR1+HPC）在动物肿瘤转移中起到决定的作用,VEGFR1+HPC并非以前发现的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）即VEGFR2阳性造血祖细胞,而是同时具备CD133和VEGFR1两种标记的一种造血祖细胞,因为腹腔注射VEGFR2抗体,不能阻断VEGFR1+HPC细胞簇形成及瘤转移灶形成,只能限制肿瘤转移灶生长。利用β半乳糖苷酶标记骨髓细胞移植的小鼠Lewis肺癌模型、小鼠B16黑色素瘤模型和c-myc转基因小鼠自发性淋巴瘤模型发现:VEGFR1+HPC首先在特定器官形成细胞簇（VEGFR1+HPC cellular clusters）,为瘤细胞准备了易于形成转移的微环境,这些细胞簇形成部位与肿瘤转移常见部位一致。肿瘤转移到某种特定器官的细胞和分子机制还不是很清楚,但是很多肿瘤都有转移到某一特定器官的倾向。依靠肿瘤转移相关细胞标签—VEGFR1+造血祖细胞在靶器官形成转移的微环境,促进了肿瘤的侵袭和转移。但目前的研究均采用动物受致死性辐射后进行骨髓移植的研究方法,各器官存在辐射损伤后可能会造成非特异性骨髓动员及骨髓来源细胞的聚集,且尚未在人癌实验层次获得证实。本研究主要以人大肠癌为研究对象探讨造血祖细胞对肿瘤转移的作用,分三部分进行,首先从临床病理角度利用免疫组织化学方法检测VEGFR1+HPC细胞簇在大肠癌伴有癌转移淋巴结和未伴有癌转移淋巴结组织中的形成情况;其次利用大肠癌原位移植肝转移裸鼠模型,应用FCM观察转移灶内VEGFR1阳性造血祖细胞与大肠癌细胞的数量与比例及其相互关系,应用Western Blot观察转移相关因子的表达;最后分离人脐血CD133+造血祖细胞,观察体外培养条件下其对于大肠癌肿瘤细胞增殖、黏附以及侵袭能力的影响。研究内容:1用免疫组织化学方法检测VEGFR1+HPC在大肠癌伴有癌转移淋巴结和未伴有癌转移淋巴结组织中的形成情况。2将人大肠癌细胞株SW480/M5和SW480/EGFP+瘤块原位接种至裸鼠结肠,建立大肠癌原位移植转移裸鼠模型,应用FCM观察转移灶内VEGFR1阳性造血祖细胞与大肠癌细胞的数量与比例及其相互关系,应用Western Blot观察转移相关因子MMP-9、SDF-1的表达。3分离人脐血CD133+造血祖细胞,观察体外培养条件下其对于大肠癌肿瘤细胞增殖、黏附以及侵袭能力的影响。主要方法和结果:1应用免疫组织化学方法检测人造血祖细胞在大肠癌伴有癌转移淋巴结和未伴有癌转移淋巴结组织中的定位情况。结果显示:造血祖细胞主要定位在淋巴结的被膜下、淋巴窦、小血管和癌转移灶旁边。在伴有癌转移淋巴结和未伴有癌转移淋巴结组织均可以发现,并且形成大小不等的细胞簇。2结肠原位接种SW480/M5和SW480/EGFP+瘤块自发转移动物模型的建立。分别将SW480/M5和SW480/EGFP+细胞悬液制成5×106/ml,注射裸鼠皮下,14d后处死裸鼠,取瘤块接种于结肠部位,术后观察裸鼠的原位成瘤及转移情况。6只裸鼠在大肠癌原位种植SW480/EGFP+瘤块后五周时全部处死,结果显示:SW480/EGFP+具有多向转移的潜能,肝、脾、胰腺、肾被膜、淋巴结均发生了转移,尤其腹腔种植转移能力明显强于SW480/M5细胞;大肠癌原位种植SW480/M5瘤块后不同时期分别处死6只裸鼠,结果显示:三周后没有裸鼠发生肝脏转移;五周后3只发生肝脏转移（50.0%）;七周后4只裸鼠发生肝脏转移（66.7%）。3流式细胞术观察裸鼠原位瘤块接种后不同时间VEGFR-1+HPC的量的变化SW480/M5瘤块在接种前,接种后三周、五周、七周和SW480/EGFP+瘤块接种后五周分别处死六只裸鼠,结果显示:原位接种SW480/M5瘤块前,接种后不同时间段裸鼠肝脏CD133+和VEGFR1+细胞所占比例随转移时间不断增加,并且在转移部位癌灶形成之前已经存在,各组之间均有显著性差异（F=474.570,P=0.000）;另外,同样为原位接种后五周,SW480/M5组的裸鼠肝脏组织内CD133和VEGFR1双阳性细胞比SW480/EGFP+的多,两者之间有显著性差异（t=11.619,P=0.000）。这可能与SW480/M5是肝转移亚系,较多发生肝脏转移,器官特异性较强有关。4应用Western blot分析MMP-9、SDF-1在转移前后及不同转移时间的蛋白表达情况MMP-9和SDF-1在SW480/M5原位接种前后及不同转移时间对比分析发现:裸鼠SW480/M5瘤块原位接种后三周、五周、七周肝脏内MMP-9蛋白水平,随着肿瘤转移时间MMP-9蛋白表达增强;SDF-1蛋白水平也有增强趋势。5通过免疫磁珠分选术分选出脐血CD133+造血祖细胞,体外观察其对大肠癌细胞增殖、粘附以及侵袭的影响取健康、新鲜的脐带血,采用免疫磁珠分选技术,分选出CD133+的造血祖细胞,用含20%胎牛血清的低糖DMEM体外培养1～2周后,与SW480/M5、SW480/EGFP+和SW620细胞共同培养后,采用MTT、Transwell的方法检测CD133+造血干细胞在体外培养条件下对SW480/M5、SW480/EGFP+和SW620细胞的增殖、黏附以及侵袭能力的影响。免疫磁珠分选技术分选的脐血CD133+造血祖细胞阳性率高达73%以上,分选出的CD133+造血祖细胞体外培养1～2周,不会诱导分化,仍保留祖细胞的特征。首先利用FN黏附试验检验细胞的黏附能力,结果显示加入CD133+脐造血祖细胞后SW480/M5的黏附能力强于对照组SW480/M5（t=2.731,P=0.014）;加入CD133+脐造血祖细胞后SW480/EGFP+的黏附能力强于对照组SW480/EGFP+（t=2.512 P=0.022）;加入CD133+脐造血祖细胞后SW620的粘附能力强于对照组SW620（t=6.126,P=0.000）。其次利用运动小室的方法对CD133+脐造血祖细胞对SW480/M5、SW480/EGFP+以及SW620三种细胞的运动能力进行了比较,结果显示:加入CD133+脐造血祖细胞后SW480/M5的运动能力强于对照组SW480/M5（t=6.481,P=0.000）;加入CD133+脐造血祖细胞后SW480/EGFP+的运动能力强于对照组SW480/EGFP+（t=4.181,P=0.003）;加入CD133+脐造血祖细胞后SW620的运动能力强于对照组SW620（t=3.491,P=0.008）。最后,又对CD133+脐造血祖细胞分别对SW480/M5、SW480/EGFP+和SW620增殖能力的影响进行了检验。96孔板中,SW480/M5细胞和CD133+脐造血祖细胞,相同数量的肿瘤细胞代替CD133+脐造血祖细胞作为对照组,共同接种后的第二天,细胞数目就超过了对照组细胞（t=3.941,P=0.001）;SW480/EGFP+细胞和CD133+脐造血祖细胞,相同数量的肿瘤细胞代替CD133+脐造血祖细胞作为对照组,共同接种后的第二天,细胞数目就超过了对照组细胞（t=2.776,P=0.012）;SW620细胞和CD133+脐造血祖细胞,相同数量的肿瘤细胞代替CD133+脐造血祖细胞作为对照组,共同接种后的第二天,细胞数目就超过了对照组细胞（t=7.580,P=0.000）。结论:1大肠癌患者淋巴结组织中可见VEGFR1+HPC细胞簇形成,在没有转移癌灶的淋巴结亦可以见到,但伴有癌转移的淋巴结转移组比非转移组VEGFR1+HPC细胞簇含量高,并且在没有转移癌灶的淋巴结也可以见到,而在非癌患者如淋巴结反应性增生、慢性扁桃体炎组织中,则不形成VEGFR1+HPC细胞簇,提示VEGFR1+HPC细胞簇形成可能与人大肠癌转移相关,其形成是持续性的,而不仅限于转移前。2原位接种瘤块前裸鼠肝脏组织内无VEGFR1阳性细胞簇,原位接种瘤块后不同时间裸鼠肝脏VEGFR1阳性细胞随转移时间不断增加,并且在转移部位癌灶形成之前已经出现。VEGFR-1+HPC可能在大肠癌转移中起着重要的作用。3免疫磁珠分选脐血CD133+造血祖细胞,在体外培养的条件下,与大肠癌细胞共培养可以显著增强大肠癌细胞的增殖、黏附以及侵袭能力。4应用Western Blot通过对MMP-9、SDF-1在转移前后及不同转移时间对比分析发现:裸鼠原位接种后不同时间段肝脏内MMP-9蛋白水平与肿瘤转移正相关,随着肿瘤转移时间MMP-9蛋白表达增强;SDF-1蛋白水平也呈增强趋势。说明人大肠癌转移可能与转移相关因子MMP-9,SDF-1表达增强有关。本研究的创新之处:1在人癌实验层次上证实了VEGFR-1+HPC对肿瘤转移的促进作用,为抗肿瘤转移研究提供了实验基础;2成功分选了脐血CD133+造血祖细胞,并在体外培养的条件下直接观察其对大肠癌细胞增殖、黏附及侵袭能力的影响;3采用Western Blot技术,探讨人大肠癌转移灶转移相关因子MMP-9、SDF-1的表达情况,初步探讨两者与肿瘤转移的关系。