论文摘要
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)具有相当高的变异性,HCV感染后多数可发展为慢性丙型肝炎,部分患者可进一步发展为肝硬化和肝癌。HCV基因型可以明显影响α干扰素抗病毒治疗的疗效,其中1型与2型HCV感染相比应答率较低。NS3蛋白是一种多功能蛋白,在病毒的生命周期中起重要作用,因而成为新型抗HCV药物的最主要的靶点。NS3蛋白同时也是细胞毒T淋巴细胞(CTL)的识别靶位。目前我国北方地区缺少近期大样本HCV基因分型资料,我国患者中HCV NS3区相关耐药变异和CTL表位变异尚未见报道。本文在对767例北方地区基因型的分析和150例HCV NS3蛋白激酶编码区序列分析,以了解我国北方地区HCV感染患者中近期HCV基因型流行状况以及蛋白酶抑制剂的天然耐药相关变异和CTL表位变异状况。目的(1)对北方地区慢性HCV感染患者的基因型进行分析,以进一步了解我国北方地区近期HCV基因型流行特点。(2)建立扩增和检测我国各种基因型HCV感染患者NS3蛋白激酶编码区序列扩增分析的方法。(3)对NS3区进行序列分析,揭示我国北方地区HCV感染患者中与NS3蛋白酶抑制剂相关耐药变异和CTL变位变异的特点。材料与方法(1)收集767例患者血清样本,其中慢性丙型肝炎患者518例,慢性丙型肝炎合并肝硬化213例,慢性丙型肝炎合并肝细胞癌36例。用基因芯片法进行HCV基因分型。(2)采用自行设计的型特异性引物介导巢式反转录多聚酶链反应(RT-PCR),对其中150例各种基因型HCV感染患者的NS3区序列进行了PCR产物直接测序分析,部分样本进行了克隆测序分析;通过进化树分析确定HCV基因型,并与基因芯片法测得的基因分型结果进行了比较;分析了NS3区中与蛋白酶抑制剂teleprovir相关耐药位点的变异。(3)采用PCR法对NS3测序患者中的114例进行了HLA-A2,A11,A24和A33分型,并对已知A2和A24限制性NS3区CTL的表位变异情况进行了分析。结果(1)北方地区767例慢性HCV感染患者的基因分型结果为:1b占59.71%,2a占30.90%,1b/2a混合感染占3.26%,6型占2.49%,3a占1.56%,3b占0.91%,1b/3a混合感染占0.52%,2a/3a混合感染占0.26%,1a占0.26%,1a/1b占0.13%。不同诊断的慢性HCV感染者间的基因型分布无显著差异。(2)建立了NS3基因扩增方法可以有效扩增各基因型HCV的NS3片段,用NS3测序的150例患者样本中, 1b占66.7%(100/150),2a占22.7%(34/150),3a占4%(6/150),3b占4%(6/150),6型占2%(3/150),1a占0.7%(1/150),与基因芯片法分型结果有较高的符合率,进化树分析未见NS3序列有地区性聚集倾向。未检出与新型HCV蛋白酶抑制剂telaprevir耐药相关的V36M/A,T54A,R155K/T和A/156V/T变异。(3)HLA分型显示,114例患者样本中检出A2阳性43例,占37.7%,A11阳性44例,占38.6%,A24阳性27例,占23.7%,A33阳性16例,占14.3%。未检出上述4种型别的有13例,占11.4%。通过对表位A2和A24的变异分析表明,在HCVNS3区A2(CINGVCWTV)/(LLCPSGHAN)和A24(AYSQQTRGL)表位均存在明显的变异情况,并且多数变异表位中有多个氨基酸发生了替换。结论(1)在我国北方地区以1b型HCV感染最为常见, 2a型HCV感染次之。(2)我们建立的方法可以有效扩增各个HCV基因型的NS3蛋白酶编码基因,使NS3序列分析法可同时进行基因分型和蛋白酶抑制剂耐药变异检测。(3)我国慢性HCV感染患者中对telaprevir产生病毒自然变异引起的原发耐药可能性很小。(4)NS3区CTL表位的高度变异可能是HCV慢性化的机制之一。
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