蓝光抑制拟南芥下胚轴伸长和诱导种子萌发的生化分析

论文摘要

隐花素（Cryptochrome）是植物感受蓝光的蓝光受体,它介导蓝光调节植物的光形态建成反应,如抑制下胚轴伸长、促进子叶伸展及调节开花等。但是,关于蓝光调节植物光形态建成反应如抑制下胚轴伸长的生化机制还不明确,蓝光是否影响种子萌发也没有报道。因此,本论文以模式植物拟南芥野生型和蓝光受体突变体为材料系统地研究了蓝光抑制拟南芥下胚轴伸长的生化机制,以及初步研究了蓝光对拟南芥种子萌发的影响及其生化机制。论文的具体研究结果如下:（1）通过测量培养在不同光照条件下拟南芥幼苗下胚轴长度发现,T-DNA插入突变体scc7-D（suppressors of cry1cry2 7-dominant）对光特别敏感,蓝光、红光或远红光下其下胚轴比母本cry1cry2或野生型的要短,但是暗培养中scc7-D突变体幼苗下胚轴长度与母本cry1cry2或野生型的相比则无差异。采用RT-PCR分析发现,scc7-D突变体中T-DNA插入位点附近的GA2ox8基因的表达量比母本中的表达量明显增加,此基因在拟南芥中编码一种GA2ox代谢酶,该酶在拟南芥赤霉素（Gibberellin,GA）生物合成途径中将有生物活性的GA4或其前体代谢为无生物活性的GAs。施用具有生物活性的外源GA3时,scc7-D突变体幼苗的表型得到恢复。GA2ox8基因过表达株系（35S:GFP-GA2ox8-1和35S:GFP- GA2ox8-8）对蓝光也特别敏感,施用具有生物活性的外源GA3也可使其表型恢复。说明不同光照条件下,光对scc7-D突变体下胚轴伸长的抑制是由于突变体内GA2ox8基因表达增加,幼苗体内有生物活性的GA含量下降所致。（2）通过比较野生型和cry1cry2、cry1、cry2突变体的下胚轴对外源有生物活性的GA3、GA4以及GA生物合成抑制剂多效唑（paclobutrazol）和嘧啶醇（ancymidol）的反应时发现:野生型和cry1cry2、cry1、cry2突变体下胚轴对外源GA3或GA4均无明显反应。但高光照强度（20-100μmolm-2 s-1）蓝光下,当多效唑和嘧啶醇浓度分别为10-2和10-1μM时,cry1和cry1cry2突变体下胚轴的伸长明显受到抑制,而对cry2突变体下胚轴伸长的抑制程度较小,最后均和野生型的下胚轴一样长。施用多效唑（10-2μM）或嘧啶醇（10-1μM）的同时施加GA3,野生型和cry1cry2、cry1、cry2突变体的下胚轴又各自恢复到原有表型。结果表明,蓝光下cry1和cry1cry2突变体的长下胚轴表型可能是由于其幼苗体内有生物活性的GA含量增加以及GA信号传导增强所致。此外,红光下phyB突变体和远红光下phyA突变体对外源GA3和GA生物合成抑制剂多效唑的反应与蓝光下cry1和cry1cry2突变体对外源GA3、GA生物合成抑制剂多效唑的反应相似。说明红光下phyB突变体和远红光下phyA突变体的长下胚轴表型也可能是由于其幼苗体内有生物活性的GA含量增加以及GA信号传导增强所致。（3）通过与澳大利亚James Reid实验室合作,采用气质联用（GC-MS）方法检测了蓝光下拟南芥野生型和cry1cry2突变体幼苗体内有生物活性的GA4含量。结果发现,将拟南芥黄化幼苗转入蓝光4h时,野生型幼苗体内GA4含量下降3倍,而cry1cry2突变体幼苗体内有生物活性的GA4含量则无变化。说明隐花素介导蓝光通过降低幼苗体内GA4含量,而抑制拟南芥下胚轴的伸长。（4）采用RT-PCR分析方法检测了不同蓝光条件处理时,拟南芥黄化幼苗中GA2ox家族基因的表达情况。GA2ox家族基因总共有8个（GA2ox1-8）,除了GA2ox3和GA2ox5基因因表达量太低而无法检测出来外,其它6个基因的表达均不同程度地受蓝光诱导。与野生型相比,cry1突变体中4个GA2ox家族基因（GA2ox1, GA2ox2, GA2ox6, GA2ox8）,尤其是GA2ox1和GA2ox8基因的表达受蓝光诱导的程度降低,而cry1cry2突变体中这几个基因的表达受蓝光诱导的程度更低,而在cry1cry2phyA突变体中GA2ox1基因的表达几乎不受蓝光诱导。说明phyA协同隐花素部分通过不同程度地诱导大多数GA2ox家族基因的表达,促进GA4或其前体代谢而介导蓝光抑制拟南芥下胚轴的伸长。此外,红光也不同程度地诱导大多数GA2ox家族基因的表达,但是红光的诱导效应可能由phyB和其它光敏素协同介导。（5）GA20ox家族基因有5个（GA20ox1-5）,采用RT-PCR分析发现,cry1、cry2和phyA协同介导蓝光不同程度地抑制GA20ox家族基因中GA20ox1、GA20ox2、GA20ox3基因的表达。其它2个基因因表达量低而无法检测。蓝光对GA20ox1基因表达的抑制作用最强,其次是GA20ox2和GA20ox3。说明phyA协同隐花素部分通过不同程度地抑制GA20ox家族基因的表达,减少GA4合成而介导蓝光抑制拟南芥下胚轴的伸长。此外,GA20ox1、GA20ox2、GA20ox3基因的表达均不同程度地受红光和远红光抑制,phyB主要介导红光抑制GA20ox3基因的表达,phyA则主要介导远红光抑制GA20ox1基因的表达,而红光和远红光对GA20ox2基因的抑制可能由phyA、phyB与其它光敏素协同介导。（6）GA2ox8基因表达增加反馈抑制光对其它GA2ox家族基因成员表达的诱导,同时则反馈促进大多数GA20ox家族基因的表达。说明拟南芥幼苗中的这种不同家族基因之间以及本家族基因成员之间的反馈调节可以更加精确的控制植物体内有生物活性的GA4含量的动态平衡,从而增强植物适应光和其它环境条件的变化。（7）长日和短日条件下GA2ox1和GA2ox2基因的表达明显受生物钟调节,生物钟节律表达的最大值与最小值的分别出现在光周期培养的光培养时期和暗培养时期。GA2ox4和GA2ox6基因的表达也表现出生物钟节律现象,但是其振幅相对GA2ox1和GA2ox2基因来说则比较小。其它两个GA2ox基因如GA2ox7和GA2ox8的表达在光周期培养过程中则表现出依赖光调的节律现象。光周期培养条件下, cry1cry2突变体中GA2ox1基因的表达不受白光诱导,说明隐花素在介导白光诱导GA2ox1基因的表达中也具有重要的作用。上述结果表明,生物钟可能通过诱导GA2ox家族基因的表达而介导光抑制拟南芥幼苗下胚轴的伸长。（8）GA20ox1和GA20ox3基因受生物钟调节。GA20ox2基因的表达在长日条件下受生物钟调节,但在短日条件下则表现出受光调节的节律。光周期培养条件下,隐花素在介导白光抑制GA20ox1基因的表达中也具有重要作用。（9）蓝光诱导拟南芥种子萌发。隐花素主要介导蓝光诱导拟南芥种子的早期（蓝光培养1-3天）萌发,并且与光照强度有关,较低光照强度（0.1-10μmolm-2 s-1）下隐花素的作用比较明显。通过施用GA生物合成抑制剂多效唑或嘧啶醇发现,相同浓度的抑制剂对cry1cry2突变体种子萌发的抑制作用比对野生型的要强,并且解除抑制剂对cry1cry2突变体种子萌发的抑制作用,所需的外源有生物活性的GA3量也较野生型的多。这些试验结果初步证实了,隐花素可能通过增加萌发种子中有生物活性的GA合成而介导蓝光诱导种子萌发。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词
• 第1章 绪论
• 1.1 植物蓝光反应突变体分子生物学研究
• 1.1.1 蓝光受体突变体及基因
• 1.1.2 蓝光信号传导下游组分突变体及基因
• 1.1.3 蓝光促进幼苗去黄化的信号传导模式
• 1.2 光调节植物幼苗生长发育和赤霉素合成、代谢酶基因表达研究
• 1.2.1 植物赤霉素生物合成途径
• 1.2.2 植物赤霉素代谢和信号传导
• 1.2.3 光敏素调节植物幼苗生长发育和GA 合成、代谢
• 1.2.4 隐花素调节植物幼苗生长发育和GA 合成、代谢
• 1.3 本论文工作设想
• 第2章 蓝光对拟南芥下胚轴伸长的抑制和GA2ox 家族基因表达的调节
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 GA2ox8 基因过表达增强植物对光的敏感性
• 2.2.2 光抑制拟南芥幼苗体内有生物活性的GA 积累
• 4 积累'>2.2.3 隐花素介导蓝光抑制拟南芥幼苗体内有生物活性的GA₄积累
• 2.2.4 隐花素和光敏素分别介导蓝光和红光诱导拟南芥GA2ox 家族基因的表达
• 2.2.5 隐花素和光敏素协同介导蓝光诱导拟南芥GA2ox 家族基因的表达
• 2.2.6 GA2ox8 基因过表达抑制光对其它GA2ox 家族基因成员表达的诱导
• 2.2.7 生物钟对GA2ox 家族基因表达的调节
• 第3章 光调节拟南芥GA20ox 家族基因的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 隐花素介导蓝光抑制拟南芥GA20ox 家族基因的表达
• 3.2.2 隐花素和光敏素协同介导蓝光抑制拟南芥GA20ox 家族基因的表达
• 3.2.3 光敏素介导红光/远红光调节拟南芥GA20ox 家族基因的表达
• 3.2.4 GA2ox8 基因过表达反馈促进GA20ox 家族基因的表达
• 3.2.5 生物钟对GA20ox 家族基因表达的调节
• 第4章 蓝光对拟南芥种子萌发的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 蓝光诱导拟南芥种子萌发
• 4.2.2 蓝光下GA 生物合成抑制剂对不同基因型拟南芥种子萌发的抑制
• 3 对抑制剂处理后不同基因型拟南芥种子萌发的恢复'>4.2.3 蓝光下外源GA₃对抑制剂处理后不同基因型拟南芥种子萌发的恢复
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 附录B RNA 干扰载体的构建和应用
• B.1 材料与方法
• B.1.1 实验材料
• B.1.2 实验方法
• B.2 结果与讨论
• B.2.1 3’-UT 和7SL-P 片段克隆
• B.2.2 RNAi 载体构建
• B.2.3 RNAi 载体的应用
• 参考文献
• 致谢