论文摘要
目的宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞的原代培养及鉴定,研究其胰岛素信号通路中胰岛素受体底物-1（IRS-1）,细胞信号转导抑制分子-1（SOCS-1）和-3（SOCS-3）的表达变化,初步探讨胰岛素抵抗发生发展的机制。方法采用母孕期饥饿法建立IUGR大鼠模型。以正常新生鼠作为对照,组织块翻转干涸培养法体外原代培养大鼠骨骼肌细胞,运用运用SABC法对骨骼肌细胞作肌动蛋白免疫组织化学染色进行鉴定。通过Real-time PCR和Western blot检测新生和12周龄IUGR大鼠骨骼肌细胞IRS-1、SOCS-1、SOCS-3mRNA和蛋白水平表达变化。结果IUGR大鼠出生时体质量、身长显著小于对照组（P均<0.05）。组织块培养法培养骨骼肌细胞生长状态良好。与对照组相比,新生和12周龄IUGR组仔鼠中骨骼肌细胞中,SOCS-1、SOCS-3的nRNA和蛋白表达水平均增加（P均<0.05）,而IRS-1的mRNA和蛋白表达水平均下降（P均<0.05）,IRS-1mRNA和蛋白表达水平均与SOCS-1、SOCS-3mRNA和蛋白表达水平呈负相关。结论原代组织块翻转干涸培养法可简单有效的体外培养大鼠骨骼肌细胞,可为后续研究稳定连续提供骨骼肌细胞。宫内发育迟缓大鼠子代骨骼肌细胞SOCS-1、SOCS-3表达增加,通过负性调节使得IRS-1表达降低,可能是骨骼肌胰岛素抵抗和成年代谢综合征发生的机制之一,提示SOCS-1和SOCS-3可以作为2型糖尿病和其他胰岛素抵抗的治疗靶点。目的构建针对大鼠细胞信号转导抑制分子-1（SOCS-1）和-3（SOCS-3）基因的短发夹RNA（shRNA）表达载体,并选取最有效shRNA模板序列进行后续研究。方法设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,进行序列测定,转染至骨骼肌细胞中。Real-time PCR和Western blot检测各组SOCS-1和SOCS-3的表达情况。结果测序证实重组质粒构建成功。四对shRNA模板序列对SOCS-1和SOCS-3的表达抑制与空白及阴性对照相比均有统计学意义（P<0.05）,且Real-time PCR和Western blot结果均一致的显示SOCS-1-shRNAb和SOCS-3-shRNAa分别干预效果最佳。结论SOCS-1和SOCS-3特异性shRNA重组表达载体构建成功,能有效抑制大鼠骨骼肌肌细胞SOCS-1和SOCS-3的表达,为后续研究及代谢综合征的基因治疗奠定了基础。目的探讨体外干预对宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞在基础状态下及不同胰岛素浓度刺激下的葡萄糖摄取的影响及机制。方法采用母孕期饥饿法建立IUGR大鼠模型,组织块法原代培养大鼠骨骼肌细胞,利用脂质体将SOCS-1和SOCS-3特异性shRNA重组质粒转染三月龄宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞,应用激光共聚焦法观察转染后骨骼肌细胞在基础状态下和不同胰岛素浓度刺激下的葡萄糖摄取变化。通过Western blot检测骨骼肌细胞中葡萄糖转运体4（GLUT4）蛋白水平表达变化和细胞信号作用通路分子Akt的磷酸化水平。结果pGPU6/GFP/Neo-SOCS-1-shRNA、pGPU6/GFP/Neo-SOCS-3-shRNA重组质粒成功构建并转染12周龄宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞及对照组后,细胞共聚焦显微镜观察骨骼肌细胞在基础状态下及不同胰岛素浓度（10-11、10-9、10-7mol/l）刺激下的GLUT4的转位较空白组均升高,且程度与胰岛素浓度成正比。Western blot检测骨骼肌细胞膜上葡萄糖转运体4（GLUT4）蛋白表达水平显示各组骨骼肌细胞在10-7mol/l胰岛素刺激下较基础状态增加,且SOCS-1-shRNA和SOCS-3-shRNA干预组较空白组GLUT4表达均增加。各组GLUT4表达水平与Akt磷酸化水平呈正相关。结论SOCS-1-shRNA和SOCS-3-shRNA均能成功下调靶基因的表达,并能改善胰岛素抵抗状态下骨骼肌细胞的葡萄糖摄取,是潜在的治疗代谢综合征新方法。
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