扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI及Aikunitz的克隆与重组表达

论文摘要

扇贝养殖是我国重要的海水养殖产业,然而自1997年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且严重影响了该产业的健康发展。丝氨酸蛋白酶抑制因子及丝氨酸蛋白酶在无脊椎动物的免疫应答中起着核心作用,它们的协同作用直接导致外界病源入侵的信号转导和级联放大,并进一步激活一系列防御体系,如黑化反应、血液凝结和抗菌肽的合成等。因此,克隆扇贝参与免疫防御的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因并对其功能进行研究,将有助于进一步研究扇贝的免疫防御机制,丰富和发展无脊椎动物免疫学的内容。运用大规模EST技术和RACE技术从栉孔扇贝中克隆出一个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因,定名为CfKZSPI。该基因cDNA序列全长1788bp,其中5’非编码区（Untranslated Region, UTR）为97 bp,3’ UTR161 bp,有一个典型的多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和一个ploy A尾巴,开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有1530 bp,编码509个氨基酸残基。对其推测氨基酸序列进行分析,发现其中包括22个氨基酸残基组成的信号肽序列和12个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。采用QRT-PCR（quantitative real time PCR）对鳗弧菌浸泡刺激后栉孔扇贝血淋巴中CfKZSPI的mRNA表达量进行了检测,发现其mRNA的表达量在鳗弧菌刺激后3h明显上升,达到空白组的43.6倍;然后在6h时有所下降,为空白组的15.0倍;随着菌刺激时间的增长,CfKZSPI基因的mRNA表达量急剧增加,在刺激后8h,12h,24h分别达到空白组的174.1,207.8,675.4倍。统计分析发现3h（P=0.019<0.05）和12h（P=0.020<0.05）时,CfKZSPI基因mRNA表达量与空白组差异均显著。为了研究栉孔扇贝CfKZSPI的蛋白活性,将其第十二个结构域克隆到pET-32a（+）载体中,转化大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）表达菌株,获得可溶性表达的蛋白rCfKZSPI-12,对其进行抑制蛋白酶活性的分析,发现其对胰蛋白酶有很强的抑制活性,而对凝血酶没有抑制活性。当rCfKZSPI-12与胰蛋白酶分子比率为1:1时,约90%的蛋白酶活性被抑制。运用狄更斯作图法研究rCfKZSPI-12对胰蛋白酶的抑制能力,结果发现其对胰蛋白酶的抑制常数为173 nmol L-1。采用同样方法从海湾扇贝cDNA文库中克隆出一个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因,定名为Aikunitz。该基因全长632 bp,其中5’ UTR为105 bp,3’ UTR为245 bp,有一个典型的多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和一个ploy A尾巴,ORF含有282 bp,编码93个氨基酸残基。推测的氨基酸序列N末端有一个20个氨基酸残基组成的信号肽序列,成熟蛋白包括一个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。采用QRT-PCR对鳗弧菌和藤黄微球菌感染后海湾扇贝血淋巴中Aikunitz的mRNA的表达量进行了检测,结果发现其在鳗弧菌刺激后3h到9h持续上升,9h时表达量为PBS对照组的4.49倍（P=0.008<0.05）,然后开始下降,在72h时表达量为对照组的0.24倍（P=0.021<0.05）;而在藤黄微球菌刺激后3h到12h其表达量上升,其中6h时为空白组的5.95倍（P=0.0004<0.01）;12h以后迅速下降,其中24h的表达量为对照组的0.38倍（P=0.028<0.05）。将Aikunitz基因编码的成熟蛋白按照重组CfKZSPI-12的方法进行重组表达,并对重组蛋白进行抑制蛋白酶和抑菌活性分析。结果发现其对胰蛋白酶和弹性蛋白酶两种丝氨酸蛋白酶都没有抑制作用。抑菌实验同样发现,重组Aikunitz对供试的革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌和大肠杆菌都不显示明显抑菌活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 一、扇贝养殖业的发展及面临问题
• 1. 扇贝养殖初期的蓬勃发展
• 2. 扇贝养殖中出现的问题
• 3. 扇贝养殖业的可持续发展
• 二、无脊椎动物固有免疫系统
• 1. 免疫系统概述
• 2. 固有免疫系统
• 2.1 免疫识别
• 2.1.1 病原相关分子模式
• 2.1.2 模式识别受体
• 2.2 免疫信号的调整放大和信号传导
• 2.2.1 丝氨酸蛋白酶级联反应
• 2.2.2 免疫信号转导的途径
• 2.3 病源体清除
• 2.3.1 细胞免疫
• 2.3.2 体液免疫
• 三、丝氨酸蛋白酶抑制剂研究
• 1. 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类
• 1.1 Kazal 家族
• 1.2 Kunitz 家族
• 1.3 Serpin 家族
• 1.4 α-巨球蛋白
• 2. 丝氨酸蛋白酶抑制剂参与免疫过程及其作用
• 2.1 调节内源蛋白
• 2.2 参与 Toll 信号通路的激活
• 2.3 参与调节前酚氧化物酶激活过程
• 2.4 参与血淋巴凝结
• 2.5 防止病原体蛋白酶的入侵
• 四、本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 一、实验材料
• 1. 构建cDNA 文库的扇贝样品及其处理
• 2. 菌刺激扇贝样品及其处理
• 3. 主要化学试剂及仪器设备
• 3.1 主要化学试剂
• 3.2 培养基和试剂的配置
• 3.3 主要仪器设备
• 二、实验方法
• 1. 扇贝总 RNA 的提取
• 1.1 实验用品的预处理
• 1.2 RNA 提取过程
• 2.c DNA 文库的构建与序列分析
• 2.1 cDNA 文库的构建
• 2.2 序列分析与目的基因片段的获得
• 3.R ACE 扩增获得cDNA 序列的5’及3’端
• 3.1 扇贝cDNA 模板第一链的合成
• 3.2 3' RACE 扩增
• 3.3 5' RACE 扩增
• 4. 琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物
• 5. 感受态细胞的制备、连接和转化
• 5.1 感受态细胞的制备
• 5.2 连接反应
• 5.3 转化
• 6. 质粒的提取
• 7. 目的基因的生物信息学分析
• 8. Real time RT-PCR 检测目的基因在组织及菌刺激后的的表达
• 8.1 荧光实时定量PCR 的原理
• 8.2 real time PCR 的引物设计
• 8.3 高效率扩增的条件的确立
• 8.4 体外刺激实验和目的基因的表达检测
• 9. 蛋白的原核重组表达
• 9.1 重组质粒构建
• 9.2 重组蛋白的表达与检测
• 9.3 重组蛋白的纯化
• 9.4 重组蛋白的复性
• 9.5 重组蛋白的浓度测定
• 10. 重组蛋白的抑制蛋白酶活性检测及动力学分析
• 11. 重组蛋白的抑菌活性
• 第三章 实验结果
• 一、栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI 的克隆，重组表达与活性
• 1. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI 全长cDNA 的获得
• 2. 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI 结构与同源性
• 2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI 结构
• 2.2 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI 的同源性
• 3. 栉孔扇贝CfKZSPI 基因的时序表达
• 4. CfKZSPI 基因单结构域的原核重组表达
• 4.1 CfKZSPI-12 Kazal 结构域的原核重组子构建
• 4.2 CfKZSPI-12 Kazal 结构域的原核重组表达与纯化
• 5. rCfKZSPI-12 抑制蛋白酶活性
• 6. rCfKZSPI-12 抑制常数的获得
• 二、海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Aikunitz 的克隆、重组表达与活性
• 1. 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Aikunitz 的获得
• 2. 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Aikunitz 的序列与同源性
• 3. 海湾扇贝Aikunitz 基因的组织表达
• 4. 海湾扇贝Aikunitz 基因在菌刺激后的表达规律
• 5. Aikunitz 基因的原核重组表达
• 5.1 Aikunitz 原核重组子构建
• 5.2 Aikunitz 原核重组表达与纯化
• 6. rAikunitz 蛋白的活性检测
• 6.1 rAikunitz 蛋白的抑制蛋白酶活性检测
• 6.2 琼脂扩散法检测rAikunitz 的抗菌活性
• 第四章 讨论
• 1. CfKZSPI 的克隆、重组表达与活性
• 2. Aikunitz 的克隆、重组表达与活性
• 第五章 结论
• 参考文献
• 博士期间发表和完成的论文
• 致谢