基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究

论文题目: 基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 肿瘤学

作者: 胡晓霞

导师: 唐步坚,李力

关键词: 基质金属蛋白酶,组织抑制剂,卵巢肿瘤,侵袭转移,反义寡核苷酸,干扰

文献来源: 广西医科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 卵巢癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,它的5 年存活率低。侵袭和转移是卵巢癌重要的生物学特征,是引起卵巢癌患者死亡的主要原因。基质金属蛋白酶(MMP)通过降解细胞外基质(ECM)在肿瘤的侵袭和转移中起了关键性的作用。而基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)可抑制MMPs 的活性,MMPs 和TIMPs 的平衡失衡可导致肿瘤浸润和转移。本研究的目的是探讨基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢癌中的表达及与卵巢癌侵袭转移的关系,同时探讨反义核酸及RNA 干扰技术对MMP-9 基因的抑制作用及对卵巢癌细胞生物学行为的影响,并探讨使用RNAi 作为一种新的基因治疗的方法。应用RT-PCR 方法检测48 例卵巢癌、21 例良性卵巢肿瘤及22 例正常卵巢组织中MMP-9、2、7 及TIMP-1、2、3 mRNA 的表达情况,进行阳性率及半定量的比较,将结果与临床及病理资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox 回归模型分析。结果显示MMP-9 阳性表达率和MMP-9、MMP-2 半定量值在卵巢恶性肿瘤组织中明显高于正常卵巢组织(P<0.05);TIMP-2、MMP-7、TIMP-3 在卵巢恶性及良性肿瘤组织中的阳性表达率及半定量值明显高于正常卵巢组织,MMP-9/TIMP-1 在卵巢恶性肿瘤组织中的比值(0.91±0.67)明显高于正常卵巢组织(0.15±0.34);MMP-9 表达水平与卵巢恶性肿瘤的手术病理分期及预后有关,在Ⅲ-Ⅳ期患者中的表达(1.13±0.66)显著高于Ⅰ-Ⅱ期(0.60±0.54)患者(P<0.05),其阳性患者中位生存时间为43.00±17.12 个月,其累积生存率为47.37%,明显低于MMP-9 阴性者(100%)。经Cox 模型多因素生存分析,MMP-9、MMP-2、TIMP-2及残余灶大小可作为卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。研究结果提示MMP-9、MMP-2、MMP-7、TIMP-2、TIMP-3 基因在卵巢恶性肿瘤组织中的表达增加。MMP-9的高表达及MMP-9与TIMP-1 的平衡失调在晚期卵巢癌的发展中起重要作用,MMP-9 有可能作为监测晚期卵巢癌患者预后的一个指标。利用人卵巢癌组织进行RT-PCR扩增TIMP-1基因cDNA,获目的片段(631bp)连接至pcDNA4载体,转化大肠杆菌TOP10筛选阳性克隆并鉴定,并对克隆的全长片段进行DNA序列测定,构建人基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)真核表达重组质粒。利用聚合酶

论文目录:

致谢

英文缩略词

中文摘要

英文摘要

第一章 前言(综述)

1 卵巢恶性肿瘤研究进展

1.1 卵巢恶性肿瘤的遗传学研究进展

1.1.1 染色体异常与卵巢癌

1.1.2 与卵巢癌相关的基因改变

1.1.2.1 癌基因

1.1.2.2 抑癌基因

1.1.2.3 耐药相关蛋白

1.2 卵巢癌预后因素的研究概述

1.2.1 临床病理与卵巢癌预后因素的关系

1.2.1.1 临床分期与预后的关系

1.2.1.2 组织学类型、分级与预后的关系

1.2.2 临床治疗与卵巢癌预后因素的关系

1.2.2.1 手术方式及术后残余灶与预后的关系

1.2.2.2 卵巢上皮性癌一线化疗方案及疗程与预后的关系

1.2.2.3 卵巢癌综合治疗与预后的关系

1.2.3 与卵巢癌预后相关的分子生物学因素

1.2.3.1 癌基因和抑癌基因表达变化与卵巢癌预后因素的关系

1.2.3.2 肿瘤转移相关基因与卵巢癌预后因素的关系

1.2.3.3 生长因子与生长因子受体与卵巢癌预后因素的关系

1.2.3.4 细胞周期调控因子与卵巢癌预后因素的关系

1.2.3.5 细胞凋亡基因与卵巢癌预后因素的关系

1.2.3.6 血清相关因子与卵巢癌预后因素的关系

1.3 卵巢恶性肿瘤的治疗概况

1.3.1 恶性肿瘤的手术治疗

1.3.1.1 I 期卵巢上皮性癌全面分期探查术

1.3.1.2 肿瘤细胞减灭术

1.3.1.3 二次剖腹探查术

1.3.1.4 复发肿瘤的手术治疗

1.3.1.5 腹腔镜在卵巢癌治疗中的应用

1.3.1.6 保留生育功能的手术

1.3.2 卵巢癌的化学治疗

1.3.2.1 Ⅰ期卵巢癌的化疗

1.3.2.2 晚期卵巢癌化疗

1.3.2.3 卵巢癌腹腔化疗

1.3.2.4 复发性卵巢癌化疗

1.3.2.5 卵巢癌的先期化疗

1.3.3 卵巢恶性肿瘤的生物治疗

1.3.3.1 基因治疗

1.3.3.2 免疫治疗

2 卵巢恶性肿瘤的侵袭和转移

2.1 卵巢癌病灶转移的临床特征

2.1.1 腹腔种植

2.1.2 淋巴转移

2.1.3 卵巢癌转移的预后

2.2 肿瘤侵袭转移步骤

2.2.1 肿瘤侵袭-肿瘤细胞从原发瘤进入循环系统

2.2.2 肿瘤转移-肿瘤细胞从循环系统进入继发器官

2.3 卵巢恶性肿瘤浸润转移的分子机理

2.3.1 基因调控与肿瘤侵袭转移

2.3.2 粘附分子与卵巢恶性肿瘤浸润转移

2.3.3 血管生成与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移

2.3.3.1 肿瘤血管生成(angiogenesi)的过程

2.3.3.2 血管生成调节因子

2.3.3.3 血管生成促进肿瘤生长和扩散的可能机制

2.3.3.4 血管生成与卵巢恶性肿瘤

2.3.4 纤维蛋白溶解酶及其调节因子与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移

2.3.5 基质金属蛋白酶及其抑制剂与卵巢肿瘤的侵袭转移

3 基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌侵袭转移的关系

3.1 细胞外基质(ECM)的结构

3.1.1 基膜( BMs)

3.1.2 间隙结缔组织( ICT)

3.2 基质金属蛋白酶(MMPS) 简介

3.2.1 MMPs 家族

3.2.2 MMPs 结构域

3.2.3 MMPs 的生理学功能

3.3 基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPS)简介

3.4 MMPS 和TIMPS 的调节

3.4.1 MMPs 的激活

3.4.2 TIMPs 对MMPs 活性的调节

3.4.3 MMPs 的转录水平调节

3.5 TIMPS 对MMPS 在卵巢肿瘤中的表达

3.5.1 与病理类型和组织分级的关系

3.5.2 与临床分期的关系

3.5.3 与预后的关系

3.6 MMPS 和TIMPS 在肿瘤侵袭和转移中的作用

3.6.1 降解细胞外基质

3.6.2 在新生血管形成中的作用

3.6.3 调节细胞粘附

4 卵巢肿瘤侵袭转移治疗研究现状及展望

4.1 血管生成抑制剂

4.2 细胞粘附因子抑制剂

4.3 金属蛋白酶抑制剂

4.4 以MMPS 为靶子的基因治疗

第二章 基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢恶性肿瘤组织中的表达

1 材料和方法

1.1 临床资料

1.1.1 组织标本

1.1.2 诊断标准

1.1.3 随访

1.1 主要试剂及配制

1.2.1 试剂

1.2.2 试剂的配制

1.3 仪器及用具处理

1.3.1 仪器

1.3.2 用具处理

1.4 引物的设计

1.5 方法

1.5.1 组织总RNA 提取

1.5.2 cDNA 合成

1.5.3 半定量PCR

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 卵巢恶性肿瘤生存率

2.2 MMP-9 与TIMP-1MRNA 的表达

2.2.1 PT-PCR 扩增结果

2.2.2 在卵巢恶性、良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达

2.2.3 在卵巢恶性肿瘤中的表达与临床病理特征的关系

2.2.4 在卵巢恶性肿瘤组织中的表达与患者预后的关系

2.3 MMP-2 与TIMP-2 MRNA 的表达

2.3.1 PT-PCR 扩增结果

2.3.2 在卵巢恶性、良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达

2.3.3 在卵巢恶性肿瘤中的表达与临床病理特征的关系

2.3.4 在卵巢恶性肿瘤组织中的表达与患者预后的关系

2.4 MMP-7 与TIMP-3 MRNA 的表达

2.4.1 PT-PCR 扩增结果

2.4.2 在卵巢恶性肿瘤、良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达

2.4.3 在卵巢恶性肿瘤组织中的表达与临床病理特征的关系

2.4.4 在卵巢恶性肿瘤组织的表达与预后的关系

2.5 COX比例风险模型预后分析

3 讨论

3.1 MMPS、TIMPS 在肿瘤中的作用及关系

3.2 MMP-9、TIMP-1 MRNA 的表达与卵巢肿瘤的关系

3.3 MMP-2、TIMP-2 MRNA 的表达与卵巢肿瘤的关系

3.4 MMP-7、TIMP-3 MRNA 的表达与卵巢肿瘤的关系

第三章 TIMP-1 真核表达质粒的构建及在卵巢肿瘤组织中突变的检测

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本

1.1.2 质粒与菌株

1.1.3 试剂

1.1.4 仪器

1.2 原理

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计与合成

1.3.2 TIMP-1 全长cDNA 的PCR 扩增

1.3.3 PCR 产物的纯化与回收

1.3.4 大肠杆菌感受态细菌的制备

1.3.5 TOPO 克隆反应

1.3.6 质粒DNA 转化感受态大肠杆菌TOP10

1.3.7 挑选氨苄抗性克隆

1.3.8 质粒DNA 的快速提取

1.3.9 PCR 法鉴定

1.3.10 重组质粒的测序

1.3.11 序列分析

1.3.12 SSCP 的PCR 扩增

1.3.13 聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.3.14 银染色

1.3.15 回收目标条带进行PCR 反应及产物测序

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 TIMP1 CDNA 的PCR 结果

2.2 质粒电泳结果

2.3 PCR 法重组质粒的鉴定结果

2.4 TIMP-1 全序列测定结果及BLAST 分析

2.5 PCR 结果

2.6 SSCP 结果

2.7 回收条带的PCR 测序结果

3 讨论

第四章 MMP-9 反义寡核苷酸对卵巢癌细胞生物学行为的影响

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

1.2 试剂的配制

1.3 仪器

1.4 寡核苷酸的设计与合成

1.5 引物的设计与合成

1.6 卵巢癌细胞MMP-9、MMP-2 及TIMP-1 表达的检测

1.6.1 细胞培养

1.6.3 纤粘连蛋白诱导卵巢癌细胞MMP-9、MMP-2 的mRNA 及蛋白的表达

1.6.4 Western Blot 检测蛋白的表达

1.7 MMP-9 反义寡核苷酸转染卵巢癌细胞

1.7.1 实验分组

1.7.2 Lipofectimine 介导的寡核苷酸转染(以24 孔板为例)

1.8 绿色荧光蛋白载体(PEGFP-N1)的转染

1.9 姬姆萨染色法

1.10 MMP-9 的MRNA、蛋白及酶活性的检测

1.10.1 RT-PCR 检测MMP-9 mRNA 的表达

1.10.2 Western Blot 检测MMP-9 蛋白的表达

1.10.3 明胶酶谱法(Zymography)进行酶活性的检测

1.11 细胞生物学特性观察

1.11.1 细胞生长曲线测定法(活细胞计数法)

1.11.2 细胞集落形成测定

1.11.3 流式细胞仪检测细胞生长周期的变化

1.12 细胞侵袭粘附能力的测定

1.12.1 细胞体外侵袭能力测定(Matrigel Invasion Assay)

1.12.2 细胞体外迁移能力测定(Transwell Migration Assays)

1.12.3 细胞体外黏附能力测定(Cell Adhersion Assay)

1.13 统计学方法

2 结果

2.1 卵巢癌细胞株MMP-9、MMP-2、TIMP-1 MRNA 的表达

2.2 纤粘连蛋白诱导后卵巢癌细胞MMP-9、MMP-2 的MRNA 及蛋白的表达

2.3 LIPOFECTIMINE 介导的转染效率的观察

2.4 转染对细胞MMP-9 MRNA、蛋白及酶活性表达的影响

2.4.1 MMP-9 mRNA 的表达

2.4.2 细胞MMP-9 蛋白表达

2.4.3 MMP-9 明胶酶活性的表达

2.5 转染对卵巢癌细胞生物学特征的影响

2.5.1 细胞形态的影响

2.5.2 细胞生长曲线的影响

2.5.3 克隆形成率的影响

2.6 MMP-9 反义寡核苷酸对卵巢癌细胞侵袭粘附能力的影响

2.6.1 细胞体外侵袭能力的检测

2.6.2 细胞体外迁移能力的测定

3 讨论

第五章 RNA 干扰抑制卵巢癌细胞MMP-9 基因表达的研究

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

1.2 RNAI 实验

1.2.1 实验原理

1.2.2 siRNA 的选择及引物设计

1.2.2.1 基因序列的选择

1.2.2.2 下游引物序列

1.2.2.3 下游引物设计

1.2.3 实验分组

1.2.4 dsRNA 合成及转染

1.3 绿色荧光蛋白载体(PEGFP-N1)的转染

1.4 RT-PCR

1.5 WESTERN BLOT

1.6 细胞生长曲线测定法(MTT 比色法)

1.7 .细胞体外侵袭能力测定(MATRIGEL INVASION ASSAY)

1.8 细胞体外粘附能力测定(CELL ADHERSION ASSAY)

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 DNA 的扩增与纯化

2.2 转染效率

2.3 SIRNA 对卵巢癌细胞HO-8910PM MMP-9 MRNA、蛋白表达的影响

2.3.1 MMP-9 mRNA 的表达

2.3.2 MMP-9 蛋白的表达

2.4 细胞生长曲线的变化

2.5 SIRNA 抑制MMP-9 基因表达对卵巢癌细胞侵袭粘附能力的影响

2.5.1 细胞体外侵袭能力的检测

2.5.2 细胞体外粘附能力测定

3 讨论

小结

参考文献

附彩图

学习期间发表论文

发布时间: 2005-08-08

参考文献

• [1].WWOX基因在卵巢癌浸润转移机制的研究[D]. 张洁清.广西医科大学2007
• [2].ALDH5A1对卵巢癌细胞的生物学影响及与卵巢癌预后关系的研究[D]. 田训.华中科技大学2017
• [3].戊酸雌二醇和黑升麻异丙醇提取物对卵巢切除小鼠的影响及其机制探讨[D]. 吴飞.北京协和医学院2016
• [4].Annexin A2对卵巢癌生物学行为的影响及机制研究[D]. 刘琰.郑州大学2017
• [5].卵巢切除大鼠主动脉晚期糖化终末产物和血脂的变化及大豆异黄酮的干预作用[D]. 葛喜珍.河北医科大学2003
• [6].去卵巢后脂联素和骨钙素对骨健康的影响[D]. 贾马斯（Camara Ce）.华中科技大学2014

相关论文

• [1].趋化因子受体在浆液性上皮性卵巢癌腹腔内转移中的作用[D]. 徐常恩.复旦大学2004
• [2].卵巢癌相关新基因NM23-H1B的克隆和功能研究[D]. 李文.第二军医大学2004
• [3].VEGF对CD34～+造血干/祖细胞来源的树突状细胞分化和功能的影响及其在卵巢癌免疫中的作用和相关机制[D]. 叶枫.浙江大学2005
• [4].重组逆转录病毒介导的k-Ras/c-Myc小鼠卵巢癌动物模型的建立和抑癌基因OPCML的克隆及其在卵巢癌中的功能研究[D]. 姚德生.广西医科大学2005
• [5].转移抑制基因Kail/CD82、ME491/CD63与integrinα5基因在卵巢癌浸润转移中作用及相关性研究[D]. 夏志军.中国医科大学2005
• [6].基质金属蛋白酶-1，-9基因多态性和肺癌易感性关系的研究[D]. 张卫强.第四军医大学2005
• [7].上皮性卵巢癌患者癌组织及血清中IGF-Ⅰ、-Ⅱ和IGF-ⅠR检测及其临床意义[D]. 闫震.山东大学2004
• [8].基质金属蛋白酶-2的基础与临床研究[D]. 胡晓慧.苏州大学2005
• [9].组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究[D]. 王素梅.广西医科大学2008
• [10].卵巢上皮癌相关抗原的筛选、鉴定、血清学检测及抗原基因生物学功能的初步研究[D]. 阳志军.广西医科大学2008

标签：基质金属蛋白酶论文;  组织抑制剂论文;  卵巢肿瘤论文;  侵袭转移论文;  反义寡核苷酸论文;  干扰论文;