植物NPR1及NPR1-like基因的克隆与功能分析

论文摘要

NPR1（nonexpressor of PR gene）基因可调控植物广谱抗性的发生,在植物系统抗性中起着关键作用。植物NPR1基因已成为植物抗病信号传导途径,以及植物抗病基因工程领域的研究热点。从不同植物中克隆NPR1基因及NPR1-like基因,并进行基因表达特点和抗病功能的研究,对于丰富NPR1理论基础和进一步在植物抗病基因工程中的应用都具有重要的意义。本文分别以棉花品种鲁棉22和心叶烟为材料,从棉花植株中首次克隆出1个NPR1同源基因（GhNPR1）,从心叶烟中首次克隆出2个NPR1同源基因（NgNPR1、NgNPR3）,在此基础上,分别对它们的表达特点及其抗病的生物学功能进行了分析。具体结果如下:1.根据同源序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从棉花（Gossypium hirsutum）中克隆到一个NPR1基因,命名为GhNPR1,GenBank注册号为EF988657。通过对其分子结构和氨基酸结构的对比分析,证明该基因为NPR1的同源基因。Southern杂交说明在棉花基因组中GhNPR1为单拷贝。Northern杂交发现GhNPR1在棉花中的表达不仅具有组织特异性而且还具有时间特异性。此外,植物抗病反应相关信号分子SA、MeJA、ET可以诱导GhNPR1的表达,同样给棉花接种棉花枯萎病菌和角斑病菌后,发现GhNPR1的表达量也逐步增加,进一步证表明GhNPR1可能参与了棉花抗病反应的基因表达调控。2.从心叶烟（Nicotiana glutinosa）中同源克隆了NPR1基因,命名为NgNPR1,GenBank注册号为EU139477。利用同源序列对比及分析,证明该基因为NPR1的同源基因。并且通过NgNPR1-GFP亚细胞定位的研究,可以证明NgNPR1蛋白的结构特点与AtNPR1蛋白最为相近。RT-PCR检测NgNPR1表达特性时,发现NgNPR1基因可以被信号分子SA、MeJA、H2O2和INA诱导表达,而且细菌性病害青枯病和真菌病害烟草立枯病菌、黑茎病菌和赤星病菌接种心叶烟后,也可以不同程度的增加NgNPR1的表达量。这表明NgNPR1基因可能是SA依赖的信号转导途径的成员,参与心叶烟抗病反应的基因表达调控。3.根据已知的NPR1及NPR1-like基因的同源序列,设计简并引物,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从心叶烟（Nicotiana glutinosa）中克隆得到了一个NgNPR1-like基因,命名为NgNPR3,GenBank注册号为EF077161。同源对比分析发现,NgNPR3与拟南芥中AtNPR3同源性最高,且氨基酸结构中具有几个高度保守的典型序列结构。除此之外,NgNPR3基因组外显子-内含子结构位置的特征,也与已知的AtNPR3基因一致。因此推测NgNPR3基因是AtNPR3的同源基因。利用绿色荧光蛋白在洋葱表皮瞬时表达的实验,证明了NgNPR3蛋白可以通过SA、INA诱导而引起细胞内氧化还原电位势的变化,从细胞质运动到细胞核之中。Southern杂交说明在心叶烟基因组中NgNPR3为单拷贝。RT-PCR检测发现分别利用信号分子SA、MeJA、H2O2和INA诱导,以及接种青枯病、立枯病菌、黑茎病菌和赤星病菌后,NgNPR3在心叶烟中的表达量都会出现明显的增加,这意味着NgNPR3具有与NgNPR1基因相似的信号传导和调控体系。4.将NgNPR3构建正义植物表达载体pBI121-NgNPR3,采用农杆菌介导的方法,转化烟草NC89,同时转空载体作为对照。经卡那霉素筛选获得若干再生植株。经过PCR鉴定,并选取部分转基因植株进行了Northern和Western杂交分析,结果证明NgNPR3在转基因烟草中已成功得到表达。并且转基因植株中存在三种不同的表达量,分别为高表达（H）、中表达（M）、低表达（L）。5.选取具有代表性的三个T0代转基因株系（H、M、L）进行自交种子扩繁,得到T1代转基因植株。在分子鉴定基础上,对T1代转基因植株进行了生物学功能分析。抗真菌实验中,转基因植株在接种了烟草白粉病菌后,其抗病能力与NgNPR3基因的表达量成正比关系。即NgNPR3表达量高的植株（H、M）具有较高的抗性,低表达（L）植株与对照植株抗性很低。通过RT-PCR鉴定侵染后植株中PR基因的表达含量,证明高表达植株可以加快提高PR基因的表达,从而提高抗病能力。实验结果说明SAR诱导后NgNPR3基因也是诱导下游PR基因表达的重要调控因子。6.构建原核表达载体pET-NgNPR3,并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达融合蛋白,将特异诱导带切下,溶于PBS中获得抗原,免疫小鼠,制备抗体,从而对转基因植株进行Western杂交。

论文目录

• 英文缩写符号及其中英文对照表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 植物抗病基因工程的研究
• 1.1 基因对基因假说
• 1.2 过敏反应
• 1.3 系统获得性抗性
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 信号传导途径
• 1.3.3 PR 蛋白
• 1.4 诱导系统抗性
• 2 NPR1 基因的研究进展
• 2.1 NPR1 基因的发现
• 2.2 NPR1 在植物抗病性中的重要作用
• 2.2.1 NPR1 基因在SAR 中的作用
• 2.2.2 NPR1 基因在ISA 中的作用
• 2.2.3 NPR1 基因在R 基因决定的抗性中的作用
• 2.3 NPR1 的抗病机制
• 2.3.1 NPR1 的存在形式
• 2.3.2 NPR1 亚细胞定位研究
• 2.3.3 NPR1 与TGA 转录因子互作功能的研究
• 3 本课题的研究意义及目的
• 第二章 棉花GhNPR1 的克隆与表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物材料培养与处理
• 1.1.3 菌株与质粒
• 1.1.4 酶与各种生化试剂
• 1.1.5 PCR 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 植物总RNA 的提取
• 1.2.2 cDNA 第一链的合成
• 1.2.3 cDNA 的回收纯化
• 1.2.4 cDNA 的5′加尾反应
• 1.2.5 简并引物PCR 获得GhNPR1 中间片段
• 1.2.6 5′RACE 获得5′端序列
• 1.2.7 3′RACE 获得 3′端序列
• 1.2.8 cDNA 全长序列的获得
• 1.2.9 GhNPR1 全长基因组序列的获得
• 1.2.10 电泳目的片段的回收
• 1.2.11 DNA 片段与克隆载体的连接
• 1.2.12 大肠杆菌感受态细胞制备
• 1.2.13 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 1.2.14 质粒DNA 的提取
• 1.2.15 对重组质粒的酶切鉴定
• 1.2.16 Northern 杂交
• 1.2.17 Southern 杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 GhNPR1 基因的克隆
• 2.1.1 棉花RNA 的提取与反转录
• 2.1.2 GhNPR1 中间片段的克隆
• 2.1.3 GhNPR1 5′片段的克隆
• 2.1.4 GhNPR1 3′片段的克隆
• 2.1.5 GhNPR1 全长cDNA 的克隆
• 2.2 GhNPR1 的序列分析
• 2.2.1 GhNPR1 全长 cDNA 分析
• 2.2.2 GhNPR1 编码蛋白序列分析
• 2.2.3 GhNPR1 基因组序列分析
• 2.3 GhNPR1 在棉花基因组中的拷贝数分析
• 2.4 GhNPR1 的表达特性分析
• 2.4.1 GhNPR1 组织特异性和时间特异性表达
• 2.4.2 信号分子对GhNPR1 mRNA 水平的影响
• 2.4.3 生物胁迫下 GhNPR1 mRNA 水平的积累
• 3 讨论
• 第三章 心叶烟NgNPR1 的克隆与表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物材料培养与处理
• 1.1.3 菌株与质粒
• 1.1.4 酶与各种生化试剂
• 1.1.5 PCR 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1-1.2.15 同第二章 1.2.1-1.2.15
• 1.2.16 NgNPR1-GFP 表达载体的构建
• 1.2.17 农杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.18 冻融法转化农杆菌
• 1.2.19 融合蛋白在植物细胞内的瞬时表达
• 2 结果与分析
• 2.1 NgNPR1 基因的克隆
• 2.1.1 心叶烟RNA 的提取与反转录
• 2.1.2 NgNPR1 中间片段的克隆
• 2.1.3 NgNPR1 5′片段的克隆
• 2.1.4 NgNPR1 3′片段的克隆
• 2.1.5 NgNPR1 全长cDNA 的克隆
• 2.2 NgNPR1 的序列分析
• 2.2.1 NgNPR1 全长cDNA 分析
• 2.2.2 NgNPR1 编码蛋白序列分析
• 2.2.3 NgNPR1 基因组序列分析
• 2.3 NgNPR1 亚细胞定位分析
• 2.4 NgNPR1 的表达特性分析
• 2.4.1 信号分子对NgNPR1 mRNA 水平的影响
• 2.4.2 生物胁迫下NgNPR1 mRNA 水平的变化
• 3 讨论
• 第四章 心叶烟NgNPR3 的克隆、表达与功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物材料培养与处理
• 1.1.3 菌株与质粒
• 1.1.4 酶与各种生化试剂
• 1.1.5 PCR 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1-1.2.17 同第二章 1.2.1-1.2.17
• 1.2.18 NgNPR3-GFP 表达载体的构建
• 1.2.19-1.2.21 同第三章 1.2.17-1.2.19
• 1.2.22 植物正义表达载体的构建
• 1.2.23 农杆菌介导转化烟草
• 1.2.24 原核表达及抗体制备
• 1.2.25 Western 杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 NgNPR3 基因的克隆
• 2.1.1 心叶烟RNA 的提取与反转录
• 2.1.2 NgNPR3 中间片段的克隆
• 2.1.3 NgNPR3 5′片段的克隆
• 2.1.4 NgNPR3 3′片段的克隆
• 2.1.5 NgNPR3 全长cDNA 的克隆
• 2.2 NgNPR3 的序列分析
• 2.2.1 NgNPR3 全长cDNA 分析
• 2.2.2 NgNPR3 编码蛋白序列分析
• 2.2.3 NgNPR3 基因组序列分
• 2.3 NgNPR3 在棉花基因组中的拷贝数分析
• 2.4 NgNPR3 瞬时核定位的研究
• 2.5 NgNPR3 的表达特性分析
• 2.5.1 信号分子对NgNPR3 mRNA 水平的影响
• 2.5.2 生物胁迫下NgNPR3 mRNA 水平的变化
• 2.6 NgNPR3 基因的原核诱导表达及抗体制备
• 2.7 NgNPR3 在烟草中的超表达及其转基因烟草的抗性鉴定
• 2.7.1 转基因烟草表达载体的构建
• 0代转基因植株的 PCR 鉴定'>2.7.2 T₀代转基因植株的 PCR 鉴定
• 0代转基因植株的 Northern 杂交'>2.7.3 T₀代转基因植株的 Northern 杂交
• 0代转基因植株的 Westhern 杂交'>2.7.4 T₀代转基因植株的 Westhern 杂交
• 1代转基因植株的 PCR 鉴定'>2.7.5 T₁代转基因植株的 PCR 鉴定
• 1代转基因植株抗真菌分析'>2.7.6 T₁代转基因植株抗真菌分析
• 2.7.7 抗病植株中PR 蛋白的变化
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文