论文摘要
背景神经干细胞的发现,更新了以往认为神经元不能再生的传统观点,使人们对神经系统的结构和功能有了一个全新的认识,并且也为临床对脑和脊髓外伤、以及其他神经系统疾患提供了一个新的有效治疗途径,但因其不易获得且存在伦理学问题,实用性受到很大限制。脂肪来源的多能干细胞（Adipose-derived stem cells,简称ADSCs）具有来源丰富、采集方便、体外扩增快和自体移植等特点,预示了此种来源的干细胞在临床细胞移植治疗上将具有很大的优势。有研究报道,脂肪干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞,移植入缺血脑组织后可通过分化为神经元等细胞和分泌神经保护性生物因子等途径而达到修复作用。目的研究ADSCs在一定的培养条件下可被诱导成神经干细胞并进一步分化成神经元样细胞,并表达神经干细胞特异性标记物Nestin和神经元特异性标记物NSE。探索使用超顺磁性纳米氧化铁颗粒（SPIO）和多聚左旋赖氨酸（PLL）复合物对脂肪干细胞进行磁性标记和MRI用于示踪磁性标记ADSCs的可行性,探索脑缺血损伤后脂肪干细胞移植治疗脑组织损伤的作用机制。方法Sprague-Dawley大鼠（鼠龄2～4个月）过量麻醉处死,无菌条件下取出腹股沟脂肪组织,使用胶原酶Ⅰ消化,分离、培养得到ADSCs,取培养的第三代ADSCs使用神经干细胞培养基诱导分化,检测诱导后的ADSCs表达神经干细胞标志物和ADSCs分化后表达神经元特异性标志物的情况;同样取第三代ADSCs在体外使用SPIO-PLL复合物行磁性标记,台盼兰拒染试验判断磁性标记对ADSCs的活性有无影响,普鲁士蓝染色和体外MRI判断ADSCs磁性标记的有效性;36只缺血造模成功的Sprague-Dawley大鼠分成缺血对照组、PBS治疗组和磁性标记ADSCs治疗组,每组12只。造模后3天,采用立体定向仪进行细胞移植,移植位点:皮质（前囟后3 mm,旁开3mm,深4 mm）,垂直距离以颅骨外板为标准。SPIO标记组大鼠在ADSCs脑内移植后当天和第3周进行磁共振动态观察。采用改良神经损害严重程度评分（改良NSS评分）对ADSCs移植后各组动物进行神经系统行为和运动功能评估。移植后21天处死所有大鼠取下脑组织固定行神经元特异性稀醇化酶（NSE）、CD31免疫组化染色和普鲁士蓝染色。采用SPSS 10.0统计软件,所有数据均以均数±标准差表示,采用t检验,以P＜0.05表示差异具有显著性。结果1)由脂肪组织来源的多能干细胞可在体外培养并稳定增殖,ADSCs经免疫荧光染色,绝大多数细胞呈CD44阳性。2)第3代的ADSCs在诱导培养基作用下可被诱导为神经干细胞样生长的细胞团,神经干细胞标记物nestin免疫组化染色阳性,经诱导分化后表达神经元标记物NSE。3)传代至第3代的ADSCs体外行SPIO+PLL复合物标记后进行Prussian Blue染色,几乎所有的磁性标记ADSCs胞质内均可见多少不等的蓝染铁颗粒,标记率为100%,而未经PLL修饰的SPIO标记ADSCs,仅少数细胞胞质内见蓝染的铁颗粒;各时相点磁标记细胞的Typan Blue拒染率与未标记细胞间无统计学意义（P＞0.05）。体外MR成像时,SPIO-PLL标记的ADSCs于T2WI上可使MR信号明显减低。4)将SPIO-PLL标记和未标记的ADSCs移植到正常的SD大鼠双侧大脑实质中,1周后使用1.5T MR扫描仪检查,见磁性标记ADSCs移植处在T2WI和T2*WI序列均呈低信号改变,其中以T2*WI序列最为敏感,而未标记ADSCs移植处未见低信号改变。5)在ADSCs脑内移植后进行磁共振动态观察发现,损伤对侧脑内移植的磁性标记ADSCs可通过胼胝体迁移至缺血性脑损伤灶周围。脑组织NSE、CD31免疫组化染色显示部分ADSCs阳性,与MR示踪成像上所显示的低信号区相对应部脑组织普鲁士蓝染色可见染色阳性的移植细胞。6)NSS评分显示ADSCs移植组大鼠神经系统行为和运动功能改善较对照组大鼠明显（P＜0.05）。结论ADSCs可在体外一定的诱导条件下诱导成nestin表达阳性的神经干细胞样生长的细胞团,且可进一步分化成神经元样细胞。SPIO-PLL复合物可安全有效地标记ADSCs,MR成像技术可应用于示踪观察移植入受体脑内的ADSCs,ADSCs可通过直接替代分化为神经元或参与缺血后局部新生血管形成过程发挥作用。
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