论文题目: 番茄Cf-4/Avr4互作系统中信号传导基因的克隆与功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 蔬菜学
作者: 刘庆
导师: 杜永臣,冯东昕
关键词: 番茄,过敏反应,病毒诱导的基因沉默,酵母双杂交
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 叶霉病是番茄的一种主要病害,在设施生产条件下,特别是在我国的日光温室中,经常大面积发生,严重地影响番茄的产量和品质。利用寄主对病原菌的过敏反应(Hypersensitive Response,HR)是目前番茄抗叶霉病育种的主要途径。但是番茄叶霉病病菌的生理小种变化较快,给抗病育种带来一定的难度。HR是在抗病基因的编码蛋白与无毒基因编码产物激发子互作后,通过一系列信号传导途径被诱导产生的。许多研究已经表明,HR的信号传导途径在植物中是保守的。因此,研究叶霉病菌Cladosporium fulvum与番茄抗病基因在寄主体内互作以及诱导HR产生的信号传导过程及其相关基因,利用基因工程创造具有广谱抗性的育种材料,可能是番茄抗叶霉病育种的有效途径之一。荷兰瓦赫宁根大学植物病理实验室Cladosporium fulvum研究小组,在研究番茄抗叶霉病基因Cf-4和相应的生理小种的互作反应中,利用cDNA-AFLP分析技术得到了420个差异表达的cDNA片段。本论文利用病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)技术和酵母双杂交技术,对这些cDNA片段进行了筛选和功能研究。主要结果如下: 1.选择了192个利用cDNA-AFLP分析技术获得的差异表达的cDNA片段,用VIGS技术进行了大规模的功能筛选。获得了20个参与过敏反应的cDNA片段,其中15个被沉默后,使Cf-4转基因烟草的HR反应减弱,另有5个被沉默后使HR反应完全丧失,表明这5个基因在HR反应中起关键作用。 2.针对上述筛选出的20个cDNA片段,通过PCR的方法已从番茄的全长cDNA文库中获得了其中的6个cDNA克隆,有两个序列基本相同。它们的编码蛋白分别与来源于辣椒的Bs2抗病基因编码蛋白、拟南芥L19核糖体蛋白、拟南芥的一种GTP结合蛋白、拟南芥的一种TPR蛋白和甘薯的一种LRR(Leucine-Rich Repeat)受体类蛋白激酶具有较高的同源性。其中前三个基因沉默后,使HR反应完全丧失。除GTP结合蛋白和受体类蛋白激酶外,其它3个基因为首次发现参与HR反应。暂将与Bs2抗病基因编码蛋白高度同源的cDNA克隆定名为RGL(Resistance Gene Like)。 3.以RGL作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法,从番茄全长cDNA文库中筛选出两个与之互作的蛋白,分别命名为RGLIP-1和RGLIP-2(RGL Interacting Protein)。RGHP-1编码291个氨基酸,与拟南芥类囊体内腔蛋白同源性较高,RGLIP-2至少编码248个氨基酸,与拟南芥转导素高度同源。利用VIGS技术对这两个基因进行了功能分析。结果显示RGLIP-1基因沉默后导致了HR反应的减弱,而RGLIP-2基因沉默后使HR反应完全丧失,表明这两个互作蛋白均参与了过敏反应。
论文目录:
第一章 引言
1.植物抗病机制
1.1 抗病基因介导的信号传导
1.2 抗病信号传导分子
2.植物广谱持久抗病基因工程策略
2.1 抗病基因的直接利用
2.2 过敏反应(HR)的利用
2.3 系统获得性抗性(SAR)的利用
2.4 活性氧的利用
2.5 调控抗病反应的其它关键基因的利用
2.6 防御基因的直接利用
3.病毒诱导的基因沉默
3.1 简介
3.2 VIGS载体的发展
4.酵母双杂交系统
4.1 酵母双杂交系统的基本原理
4.2 酵母双杂交系统的应用
5.论文的研究目的和主要技术路线
5.1 研究目的
5.2 技术路线
第二章 用VIGS技术鉴定cDNA-AFLP中差异表达基因的功能
1.材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2.结果
2.1 参与HR反应的功能基因的筛选
2.2 ART基因的功能多态性
3.讨论
第三章 全长cDNA的克隆
1.材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2.结果与分析
2.1 全长cDNA克隆的获得
2.2 ART基因的序列分析
3.讨论
第四章 利用酵母双杂交技术在番茄全长cDNA文库中筛选与RGL互作的蛋白的基因
1.材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2.结果
2.1 222蛋白基因的PCR扩增结果
2.2 酶切分析结果
2.3 把番茄全长cDNA文库从λ噬菌体中自动亚克隆到质粒载体上的结果
2.4 PCR扩增检测结果
2.5 番茄全长cDNA文库酵母转化的结果
2.6 质粒pGBKT7，pGBKT7+222(1)和pGBKT7+222(8)的酶切分析结果
2.7 酵母双杂交的筛选
2.8 阳性克隆的测序与序列分析
3.讨论
第五章 应用VIGS技术对互作蛋白的基因进行功能分析
1.材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2.结果
2.1 PCR扩增31，403的部分片段的结果
2.2 质粒的浓度与纯度测量结果
2.3 互作蛋白基因的功能验证
3.讨论
第六章 结论
参考文献
致谢
作者简历
发表论文
附录
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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标签：番茄论文; 过敏反应论文; 病毒诱导的基因沉默论文; 酵母双杂交论文;