论文摘要
本研究目的是建立实时定量PCR （RQ-PCR）检测血标本中金黄色葡萄球菌DNA的方法并对临床标本进行初步检测,并建立RQ-PCR快速检测金黄色葡萄球菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素敏感性的方法。在论文第一部分中,选择金黄色葡萄球菌高度保守的看家基因fem A基因作为靶基因设计引物和TaqMan探针,建立RQ-PCR反应体系,并采用QIAamp（?） DNA Blood Mini Kit提取基因组DNA。对26份病人血标本和15份模拟血标本进行RQ-PCR检测。结果显示特异性好,检测限为100拷贝／μl（103 CFU／ml）,灵敏度为99.7%,特异度为94.6%。标准曲线线性关系好,R2在0.9918～0.9997之间。不同浓度的金黄色葡萄球菌样本检测的平均准确性为（96.25±2.26）%；批内及批间重复性平均变异系数（CV）分别为（8.06±0.07）%和（10.01±4.40）%。血标本中金黄色葡萄球菌（108～104）DNA平均提取效率为（111.72±20.72）%,模拟血标本阳性率为100%,临床血标本阳性率为15.4%,明显高于血培养。显示实时定量PCR可用于定量检测全血标本中金黄色葡萄球菌DNA的含量。论文第二部分,对32例外科发热患者的84份血标本进行了RQ-PCR检测。27个标本检测到金黄色葡萄球菌DNA,阳性率为32.14%,含量约4.36×103～6.39×104CFU/ml,所有患者的血培养结果均为金黄色葡萄球菌阴性。第三部分,在含有相同浓度金黄色葡萄球菌的LB培养基和血中,加入不同的抗生素,并设立生长对照,培养1、2、4、6和8小时后提取标本的基因组DNA,以金黄色葡萄球菌特异的fem A基因的引物和TaqMan探针对标本进行实时定量PCR检测。培养过程中,耐药组与生长对照组的金黄色葡萄球菌DNA拷贝数均呈对数增长,在LB液体培养基中增长约2.14～22.82倍,在新鲜全血中增长约2.20-11.69倍；敏感组金黄色葡萄球菌DNA拷贝数呈持平或减少趋势,在LB液体培养基中保持在2.98～1.30倍,在新鲜全血中则减至0.77～0.11倍；上述药敏结果与常规纸片法一致,但更快速。综合研究结果显示,RQ-PCR技术不仅可用于定量检测患者血中的金黄色葡萄球菌,检出率及速度高于血培养；同时可用于对血中的金黄色葡萄球菌进行快速、准确的药物敏感性试验。
论文目录
中文摘要英文摘要中英文名词及缩写前言第一部分 实时定量PCR检测血中金黄色葡萄球菌DNA的方法学及临床标本验证一、实验材料（一） 主要仪器（二） 试剂及耗材（三） 菌种来源（四） 标本采集二、实验方法（一） 特异性引物及TaqMan探针设计（二） LB（Luria-Bertain）培养基的制备（三） 基因组DNA提取（四） 引物有效性及特异性验证（五） 探针有效性及特异性验证（六） 标准品质粒的制备（七） 实时定量PCR引物和探针浓度优化（八） 实时定量PCR反应体系建立及实验流程（九） 检测限、灵敏度和特异度测试（十） 标准曲线建立（十一） 仪器准确性及重复性测试（十二） 模拟血标本中细菌DNA提取效率测定（十三） 模拟标本存放稳定性监测（十四） RQ-PCR对临床标本金黄色葡萄球菌的检测（十五） 统计学处理三、实验结果（一） 特异性引物及TaqMan探针序列（二） 引物和探针特异性验证（三） 菌落PCR（四） 测序（五） 比对（六） 质粒电泳（七） 质粒PCR（八） 质粒DNA拷贝数的换算（九） 实时定量PCR引物和探针浓度优化（十） 检测限、灵敏度和特异度测定（十一） 标准曲线线性范围（十二） 仪器的准确性及重复性（十三） 血标本中细菌DNA提取效率（十四） 储存标本的稳定性（十五） 临床标本检测结果四、讨论第二部分 实时定量PCR检测外科发热患者静脉血中金黄色葡萄球菌并与细菌培养结果的对照研究一、实验材料（一） 主要仪器（二） 试剂及耗材（三） 标本采集二、实验方法（一） 患者血标本培养（二） 临床血标本细菌基因组DNA提取（三） 检测限和灵敏度、特异度的确定（四） 健康成年人全血基因组的检测（五） 临床标本检测（六） 统计学处理三、实验结果（一） 健康成年人血标本检测结果（二） 发热外科患者血标本实时定量PCR检测结果（三） 外科发热患者血培养结果四、讨论第三部分 实时定量PCR检测金黄色葡萄球菌在LB培养基和血中对抗生素的敏感性一、实验材料（一） 主要仪器（二） 试剂及耗材（三） 菌种来源二、实验方法（一） LB液体培养基配制（二） 抗生素的稀释（三） LB液体培养基中药物敏感性试验（四） 健康人全血中药物敏感性试验（五） 基因组DNA的提取（六） 引物和探针、标准品（七） 实时定量PCR反应体系三、实验结果（一） LB液体培养基中金黄色葡萄球菌抗生素药物敏感性试验（二） 健康人全血中金黄色葡萄球菌抗生素药物敏感性试验四、讨论文献综述参考文献致谢个人简历
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实时定量PCR检测血中金黄色葡萄球菌DNA及快速药敏试验的方法学研究
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