论文摘要
目的：肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一。肝癌细胞的多药耐药（MDR）是肝癌化疗失败的主要原因之一。现有研究已经证实P-gp是MDR产生的机制之一,且MDR的产生总是伴随着PKC活性或含量的改变。PKCa与P-gp蛋白的表达有关。本课题为了研究在人肝细胞肝癌（HCC）中PKCa是否需要Ca2+激活,同时阐明Ca2+对人肝癌多药耐药细胞PKCa的诱导作用。方法：1.实验分组：将人肝癌细胞BEL-7402和人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM分为8组,分别为BEL-7402、BEL-7402+TMP、 BEL-7402+VRP、BEL-7402+IP3、BEL-7402/ADM、BEL-7402/ADM+TMP. BEL-7402/ADM+VRP、BEL-7402/ADM+IP3,用于激光共聚焦实验；其它实验则分为10组：BEL-7402、BEL-7402+TMP、BEL-7402+VRP. BEL-7402+TMP+IP3、BEL-7402+VRP+IP3、BEL-7402/ADM、 BEL-7402/ADM+TMP、BEL-7402/ADM+VRP BEL-7402/ADM+TMP+IP3和BEL-7402/ADM+VRP+IP3。2.实验方法：2.1测定人肝癌多药耐药细胞内钙离子的变化情况：采用激光共聚焦显微镜测定用三磷酸肌醇（IP3）、维拉帕米（VRP）和川芎嗪（TMP）分别作用人肝癌细胞以及人肝癌多药耐药细胞后细胞内Ca2+的平均荧光强度。2.2测定钙离子对人肝癌多药耐药细胞PKCa的影响：采用MTT测定用7个浓度梯度的ADM作用10组细胞,计算每组细胞的IC50；采用免疫荧光实验检测10组细胞中PKCa的荧光强度变化；用8000nmol/L的阿霉素分别作用10组细胞,采用荧光显微镜检测10组细胞内ADM的红色荧光强度的变化；采用流式细胞仪（FCM）检测10组细胞内发出ADM红色荧光的细胞占细胞总数的百分比；用高效液相色谱法（HPLC）检测10组细胞内ADM的浓度。结果：（1）激光共聚焦结果显示：空白的BEL-7402细胞及BEL-7402/ADM细胞内的Ca2+平均荧光强度分别为：574.08±3.30和665.16±2.89,两者比较P<0.05,有显著差异；BEL-7402+IP3、BEL-7402+TMP及BEL-7402+VRP的胞内钙浓度分别为：777.78±6.35、479.17±5.83和478.26±4.08,而BEL-7402/ADM+IP3、BEL-7402/ADM+TMP及BEL-7402/ADM+VRP则分别为：800.00±8.45、541.67±8.15和522.73±7.23,以上耐药组与亲本组比较,药物干预组与亲本组比较,P<0.05,具有显著性差异；（2）MTT结果显示10组细胞的IC50分别为：BEL-7402组为56.68±0.21；BEL-7402+TMP组的为28.58±0.43同空白对照组比较P<0.05; BEL-7402+VRP组的为37.95±0.29; BEL-7402+TMP+IP3组为29.52±0.37; BEL-7402+VRP+IP3组为41.35±0.52; BEL-7402/ADM组为74.03±0.30; BEL-7402/ADM+TMP组为48.38±0.18; BEL-7402/ADM+VRP组为51.62±0.34; BEL-7402/ADM+TMP+IP3组为48.04±0.13; BEL-7402/ADM+VRP+IP3组为56.06±0.12,以上耐药组与亲本组比较,药物干预组与未用药物干预组比较,P<0.05,具有显著性差异；（3）免疫荧光显微结果显示：BEL-7402/ADM组PKCa的荧光强度强于BEL-7402组,而BEL-7402+TMP组和BEL-7402+VRP组同BEL-7402组比较细胞内的PKCa的荧光强度明显减弱；而BEL-7402+TMP+IP3组和BEL-7402+VRP+IP3组分别同BEL-7402+TMP组和BEL-7402+VRP组比较,细胞内PKCa的荧光强度明显增强；5组耐药细胞组内荧光强度趋势同5组亲本细胞组内趋势；用相同方法处理的耐药组细胞同亲本组细胞相比,前者的PKCa荧光强度明显增强；（4）荧光显微结果显示：BEL-7402+TMP组和BEL-7402+VRP组同BEL-7402组比较细胞内的阿霉素的荧光强度明显增强；而BEL-7402+TMP+IP3组和BEL-7402+VRP+IP3组分别同BEL-7402+TMP组和BEL-7402+VRP组比较,细胞内阿霉素的荧光强度明显减弱；5组耐药细胞组内荧光强度趋势同5组亲本细胞组内趋势；用相同方法处理的亲本细胞和耐药细胞比较,耐药细胞组胞内阿霉素的红色荧光强度明显强于亲本细胞组；（5）FCM结果显示10组细胞中含ADM的细胞占细胞总数的百分比分别为：BEL-7402组为64.75±3.13；BEL-7402+TMP组为71.75±1.69:BEL-7402+VRP组为77.13±2.97；BEL-7402+TMP+IP3组为66.25±3.25；BEL-7402+VRP+IP3组为67.14±1.89; BEL-7402/ADM组为43.15±4.97；BEL-7402/ADM+TMP组为49.55±1.96; BEL-7402/ADM+RP组为59.05±2.39; BEL-7402/ADM+MP+IP3组为47.55±4.69; BEL-7402/ADM+RP+IP3组为48.25±1.48；以上耐药组与亲本组比较,药物干预组与未用药物干预组比较,P<0.05；具有显著性差异；（6） HPLC测定10组细胞内ADM的含量分别为：BEL-7402组、BEL-7402+MP组、BEL-7402+RP组、BEL-7402+TMP+P3组和BEL-7402+VRP+P3组细胞内ADM的浓度分别为0.73±0.18μg/mL,1.75±0.41μg/mL.1.89±0.44μg/mL、1.29±0.30μg/mL和0.96±0.23μg/mL; BEL-7402/ADM组、BEL-7402/ADM+MP组、BEL-7402/ADM+VRP组、BEL-7402/ADM+MP+P3组和BEL-7402/ADM+RP+IP3组细胞内ADM的浓度分别为0.65±0.16μg/mL1.43±0.34μg/mL,1.71±0.40μg/mL,0.83±0.20μg/mL和1.09±0.26μg/mL,以上耐药组与亲本组比较,药物干预组与未用药物干预组比较,P<0.05,具有显著性差异。结论：在人肝细胞肝癌（HCC）中PKCa需要Ca2+激活,且Ca2+对人肝癌多药耐药细胞中PKCa有诱导作用。
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