论文摘要
血管性痴呆（vascular dementia, VD）是由各种脑血管病引起的获得性智能及认知功能损害综合征,属神经内科的常见病、多发病。随着社会人口的日益老龄化和脑血管病发病率以及对疾病诊断水平的不断提高,VD的发病呈迅速增长趋势,越来越严重地威胁着老年人的身心健康,给社会和家庭带来沉重的负担。目前VD的发病机制尚不清楚,也无特殊有效的治疗方法,因此探讨和阐明VD的发病机制,对于临床制定更加合理的治疗方案,更好改善VD患者的生存质量,具有重要的价值和理论意义。事件相关电位（event-related potential,ERP）是一种较为客观地反映大脑功能状况的电生理检测技术,涉及从刺激到认知加工过程,不包括反应决定和反应执行,是对刺激进行识别和编码后形成新的信息并储存的过程,可以作为辅助诊断精神、神经性认知功能损害性疾病（如临床早期及亚临床期痴呆等）,评估病程、疗效及预后的重要指标。ERP主要由易受物理刺激特性影响的“外源性成分”如P1、N1、P2和不受刺激物理特性影响的“内源性成分”N2、P3组成。现在研究最多、临床应用最广泛的就是N2、P3电位的研究。本研究证实应用小鼠,在非麻醉状态下采取皮下插入电极的方法进行ERP电位的测试,亦可为动物的实验研究提供客观的、无创性的、定量的、有价值的电生理检测手段。本实验通过对小鼠进行反复双侧颈总动脉结扎-再灌注,制成VD的小鼠模型,并应用跳台试验、水迷宫试验对正常组、假手术组及VD模型组小鼠进行了学习、记忆成绩测定,证明多奈哌齐可改善小鼠的学习、记忆功能,亦可影响ERP电位。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）家族广泛分布于细胞浆内,是一族含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶是将细胞外刺激信号传递到细胞核,引起细胞生物学反应的重要信号传导系统,是细胞内信号转导的重要通路。MAPK家族的信号转导通路,采用三级激酶级联传递信号。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、C-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）,又称为应激激活的蛋白激酶（stress activate protein kinase,SAPK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase, p38 MAPK）均为MAPK家族成员,不同的细胞外刺激活化不同的MAPK通路,作用于不同的底物,引起特定的细胞生理反应。这些信号通路间相互作用在体内构成一个复杂的信号网络。ERK信号通路在生长因子介导的细胞增殖过程中发挥着重要作用,JNK/SAPK及p38 MAPK多在应激条件下激活,研究表明,这两条通路的激活可能与细胞凋亡及应激时的多种病理生理过程有关。但二者激活后的生物学意义,尚未完全澄清,MAPK信号通路在小鼠的学习、记忆功能中的调节机制,VD小鼠JNK, ERK, p38 MAPK的变化目前尚未见报道。目前认为,多奈哌齐通过（1）可逆性抑制乙酰胆碱酶对乙酰胆碱的降解,增加乙酰胆碱含量,后者作用于毒蕈碱乙酰胆碱受体（M受体）可以激活ERK的表达,增加学习、记忆功能。（2）降低N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate acid,NMDA）受体亚型NR1的表达,提高海马NR2B的表达,有助于调整学习和记忆。（3）多奈哌齐可增加脑血流量,减轻淀粉样蛋白的神经毒性及减轻自由基损伤导致的神经变性作用等,亦有助于VD小鼠的治疗。（4）多奈哌齐可能是通过减少锥体细胞损伤,保护细胞正常的神经电生理功能,使ERP潜伏期较低灌注大鼠有所缩短。研究认为,多奈哌齐可明显改善大鼠的学习、记忆功能。但对于VD小鼠JNK, ERK,p38 MAPK的变化的影响及VD小鼠ERP的作用目前尚未见报道。本实验应用免疫组化技术、原位杂交技术对VD小鼠海马细胞的ERK、JNK、p38 MAPK的表达进行测定,并将各组跳台试验、水迷宫试验的学习、记忆成绩与海马细胞的ERK、JNK、p38 MAPK的表达进行相关性分析,结果证明了正常组、假手术组无论是学习、记忆成绩或是MAPK信号转导通路均与VD模型组小鼠有显著性差异,VD模型组小鼠学习、记忆功能减退,JNK,p38 MAPK增加,两者成正相关,而ERK降低,成负相关,证明了MAPK信号转导通路参与了小鼠的学习、记忆功能的机制。而多奈哌齐的应用可以通过减少JNK,p38 MAPK增加,增加ERK的表达改善VD小鼠学习、记忆功能。本实验的目的是进一步探讨VD小鼠ERP的变化、MAPK家族在VD发病中的表达的变化及其机制,多奈哌齐对其影响。1 VD小鼠模型的建立及VD小鼠学习、记忆成绩的测试1.1目的:研究VD小鼠模型的建立及VD小鼠学习、记忆成绩的测试方法,各组分别进行跳台试验及水迷宫试验,测试学习成绩、试记忆成绩,为进一步研究VD发病机制、防治措施及评价疗效奠定基础。1.2方法:1.2.1动物分组与模型制备:实验动物选用3月龄雄性昆明小鼠306只,购自河北医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK（冀）2003-1-003,清洁级2级,体重（32.5±2.5）g,适应性饲养1周,然后将小鼠随机分为正常对照组（n=78）、假手术组（n=77）、VD模型组（n=75）、多奈哌齐组（n=76）。采用颈总动脉线结反复缺血再灌注法制备模型,假手术组仅暴露双侧颈总动脉而不结扎,且尾部不放血。多奈哌齐组为制备模型术后第2天,给予盐酸多奈哌齐灌胃,剂量3mg·㎏-1·d-1,每天1次。同时模型组、假手术组给予生理盐水,剂量0.01ml·㎏-1·d-1,每天1次。1.2.2学习、记忆成绩测试:术后第29天,分别进行跳台试验和水迷宫试验。测试跳台试验,反应时间（sec）和错误次数（number/5min）作为学习、记忆成绩,水迷宫试验游完全程时间（sec）和错误次数（number/3min）作为学习、记忆成绩。术后第30天,进行跳台试验和水迷宫试验,测试跳台试验,潜伏时间和错误次数作为记忆成绩,水迷宫试验游完全程时间和错误次数作为记忆成绩。1.3结果:1.3.1学习成绩1.3.1.1跳台试验结果显示:（1）与正常对照组的反应时间（53.62±23.32）s和假手术组的反应时间（50.26±20.48）s比较,VD模型组小鼠的反应时间（84.22±14.38）s明显延长（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠学习阶段的反应时间比较,多奈哌齐组小鼠的反应时间（55.43±25.38）s明显缩短（P<0.05）。（3）与正常对照组的错误次数（1.31±0.63）和假手术组（1.25±0.33）比较,VD模型组小鼠（3.70±0.19）明显增加（P<0.01）。（4）与VD模型组小鼠学习阶段的错误次数比较,多奈哌齐组小鼠的错误次数（1.39±0.34）明显减少（P< 0.05）。1.3.1.2水迷宫试验结果显示:（1）与正常对照组的游全程时间（98.56±51.50）s和假手术组的游全程时间（85.54±31.88）s比较,VD模型组小鼠的游全程时间（144.57±33.26）s明显延长（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠学习阶段的游全程时间比较,多奈哌齐组小鼠的游全程时间（99.24±36.43）s明显缩短（P<0.05）。（3）与正常对照组的错误次数（15.68±6.39）和假手术组的错误次数（16.26±7.55）比较,VD模型组小鼠的错误次数（31.65±11.23）明显增加（P<0.05）。（4）与VD模型组小鼠学习阶段的错误次数比较,多奈哌齐组小鼠的错误次数（16.56±8.91）明显减少（P<0.01）。1.3.2记忆成绩1.3.2.1跳台试验结果显示:（1）与正常对照组的潜伏时间（116.71±35.78）s和假手术组的潜伏时间（145.36±25.21）s比较,VD模型组小鼠的潜伏时间（76.36±33.23）s明显缩短（P<0.05）。（2）与VD模型组小鼠记忆阶段的潜伏时间比较,多奈哌齐组小鼠的潜伏时间（116.62±35.56）s明显延长（P<0.05）。（3）与正常对照组的错误次数（0.80±0.34）和假手术组（0.33±0.12）比较,VD模型组小鼠（1.70±0.51）明显增加（P<0.05）。（4）与VD模型组小鼠记忆阶段的错误次数比较,多奈哌齐组小鼠的错误次数（0.61±0.23）明显减少（P< 0.05）。1.3.2.1水迷宫试验结果显示:（1）与正常对照组的游全程时间（83.68±32.43）s和假手术组的游全程时间（76.45±26.84）s比较,VD模型组小鼠的游全程时间（132.80±34.32）s明显延长（P<0.05）。（2）与VD模型组小鼠记忆阶段的游全程时间比较,多奈哌齐组小鼠的游全程时间（86.45±36.56）s明显缩短（P<0.05）。（3）与正常对照组的错误次数（8.96±6.12）和假手术组的错误次数（9.38±8.12）比较,VD模型组小鼠的错误次数（18.57±11.32）明显增加（P<0.05）。（4）与VD模型组小鼠记忆阶段的错误次数比较,多奈哌齐组小鼠的错误次数（10.18±6.70）明显减少。1.4结论:本实验采用颈总动脉线结反复缺血再灌注法成功地制备了小鼠VD模型,经跳台试验、水迷宫试验证实了VD小鼠存在学习和记忆功能障碍,VD模型组小鼠学习阶段的学习、记忆成绩低于正常组、假手术组,记忆阶段的记忆成绩亦低于正常组、假手术组。多奈哌齐可改善学习阶段、记忆阶段的学习、记忆成绩。2 VD小鼠ERP测定与评价及多奈哌齐的影响2.1目的:建立小鼠事件相关电位的模型、测定模式及其参考值,探讨正常组、假手术组以及具有学习、记忆功能改变的VD小鼠ERP电位的测定、变化特征及其意义及多奈哌齐对其影响。2.2方法:2.2.1动物分组与模型制备:将64例小鼠随机分为正常对照组（n=16）、假手术组（n=16）、VD模型组（n=16）、多奈哌齐组（n=16）。采用双侧颈总动脉线结反复缺血再灌注法制备VD小鼠模型。利用跳台试验和水迷宫试验观测其行为学改变。2.2.2 ERP电位测定方法:将小鼠固定在立体定位仪（自制）上,剃除耳后、头顶部及额部毛,75%酒精消毒皮肤,用0.5寸毫针刺入至矢状缝与两外耳道连线交点头皮下,斜向前约2～3mm,作为记录电极;参考电极置于耳后下方;接地电极置于前额部。采用加拿大Xltek公司生产的肌电图诱发电位测定仪,实验采用短声刺激,靶刺激频率2000Hz,概率20%;非靶刺激频率1000Hz,概率80%。刺激声强120dB,分析时间500ms,叠加300次,并显示N2潜伏期、P3潜伏期及波幅等,测定重复3次,取平均值。2.3结果:ERP电位（包括N2潜伏期、P3潜伏期及波幅）测定结果显示（1）与正常对照组N2潜伏期（147.41±56.90）ms、P3潜伏期（244.40±63.15）ms和假手术组N2潜伏期（165.12±60.66）ms、P3潜伏期（222.50±59.65）ms比较, VD模型组小鼠N2潜伏期（235.03±64.61）ms、P3潜伏期（339.12±42.26）ms明显延长（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠N2潜伏期、P3潜伏期比较,多奈哌齐组小鼠N2潜伏期（117.60±58.35）ms、P3潜伏期（249.80±50.69）ms明显缩短（P<0.01）。（3）与正常对照组P3波幅（4.79±2.07）μv和假手术组P3波幅（5.35±2.23）μv比较,VD模型组小鼠P3波幅（3.51±1.68）μv明显减低（P<0.01）。（4）与VD模型组小鼠P3波幅比较,多奈哌齐组小鼠P3波幅（4.99±2.47）μv明显增高（P<0.05）。2.4结论:建立了小鼠在非麻醉状态下采取头部皮下插入电极测定ERP的方法,为动物的实验研究提供了客观的、无创性的、定量的、有价值的电生理检测手段。证实VD模型组小鼠N2潜伏期、P3潜伏期明显长于正常组、假手术对照组,P3波幅明显低于正常组、假手术对照组。多奈哌齐组可减低小鼠的N2潜伏期、P3潜伏期,提高P3波幅。3 VD小鼠海马神经元JNK及其JNK mRNA的变化及多奈哌齐的影响3.1目的:探讨VD小鼠海马JNK及其JNK mRNA变化及多奈哌齐的影响。3.2方法:3.2.1动物分组与模型制备:将87例小鼠随机分为正常对照组（n=23）、假手术组（n=21）、VD模型组（n=22）、多奈哌齐组（n=21）。采用双侧颈总动脉线结反复缺血再灌注法制备VD小鼠模型。利用跳台试验和水迷宫试验观测其行为学改变。3.2.1 JNK测定方法:小鼠以10%水合氯醛麻醉,经灌注固定其脑组织,海马组织部位常规石蜡切片,应用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）技术观察海马CA1区JNK阳性锥体细胞的形态和分布,计算各切片海马CA1区JNK染色阳性锥体细胞相同面积数目,应用原位杂交（in situ hybridization, ISH）技术方法测定各组小鼠海马CA1区JNK mRNA表达阳性锥体细胞的变化。3.3结果:3.3.1免疫组织化学技术3.3.1.1观测海马JNK阳性细胞的形态和分布:在光镜下观察海马CA1区JNK免疫反应主要在海马细胞的细胞膜和胞浆内表达。（1）正常组、假手术组海马CA1区ICH检查有正常的JNK免疫反应阳性锥体细胞,排列正常,层次清楚,免疫反应阳性物质主要位于胞膜及胞浆内,呈棕色,胞体较大,圆形或椭圆形,染色较淡。（2）模型组JNK免疫反应阳性锥体细胞数目明显增加,有大量JNK免疫反应阳性神经元,排列紧密,染色较深。（3）多奈哌齐组的小鼠海马CA1区JNK免疫反应阳性锥体细胞数目减少,层次尚清楚,染色较淡。3.3.1.2观测海马JNK阳性锥体细胞面密度值结果: （1）与正常组的海马CA1区JNK免疫反应阳性锥体细胞面密度值（8.35±0.71）和假手术组的JNK免疫反应阳性锥体细胞面密度值（10.38±4.23）比较,VD模型组小鼠的JNK免疫反应阳性锥体细胞面密度值（30.36±17.74）明显增加（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠的JNK免疫反应阳性锥体细胞面密度值比较,多奈哌齐组小鼠的海马CA1区JNK免疫反应阳性锥体细胞面密度值（19.00±8.56）明显降低（P<0.01）。3.3.1.3小鼠学习成绩和记忆成绩与JNK免疫反应阳性细胞面密度值相关性分析:对各组海马JNK免疫反应阳性锥体细胞面密度值与小鼠学习、记忆的各项参数进行相关性分析。JNK免疫反应阳性锥体细胞面密度值增加,跳台试验小鼠反应时间延长,潜伏期缩短错误次数增多。水迷宫试验小鼠学习成绩中游完全程时间延长,错误次数增多,水迷宫试验小鼠记忆成绩中游完全程时间延长,即JNK免疫反应阳性锥体细胞面密度值增加,小鼠学习、记忆成绩下降,并存在相关性。3.3.2原位杂交技术3.3.2.1观测其海马JNK mRNA阳性细胞的形态和分布:在光镜下观察JNK mRNA主要在海马细胞核和浆表达。（1）正常组、假手术组海马CA1区ISH检查有正常的JNK mRNA表达,阳性锥体细胞,排列正常,层次清楚,阳性物质主要位于胞核及胞浆内,呈棕色,胞体较大,圆形或椭圆形,染色较淡。（2）VD模型组ISH阳性锥体细胞数目明显增加,有大量阳性神经元,排列紧密,染色较深。（3）多奈哌齐组的海马CA1区阳性锥体细胞数目减少,层次尚清楚,染色较淡。3.3.2.2观测海马JNK mRNA阳性细胞面密度值结果:JNK mRNA阳性锥体细胞结果显示:（1）与正常组的海马CA1区JNK mRNA阳性锥体细胞面密度值（9.7±2.8）和假手术组的JNK mRNA阳性锥体细胞面密度值（11.8±3.4）比较,VD模型组小鼠的JNK mRNA阳性锥体细胞面密度值（42.69±5.64）明显增加（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠的JNK mRNA阳性锥体细胞面密度值比较,多奈哌齐组小鼠的海马CA1区JNK mRNA阳性锥体细胞面密度值（17.46±8.88）明显降低（P<0.01）。3.3.2.3小鼠学习成绩和记忆成绩与JNK mRNA阳性细胞面密度值相关性分析:对小鼠各组海马JNK mRNA阳性锥体细胞面密度值与小鼠学习、记忆的各项参数进行相关性分析。JNK mRNA阳性锥体细胞面密度值增加,跳台试验小鼠反应时间延长,潜伏期缩短错误次数增多。水迷宫试验小鼠学习成绩中游完全程时间延长,错误次数增多,水迷宫试验小鼠记忆成绩中游完全程时间延长,即JNK mRNA阳性锥体细胞面密度值增加,小鼠学习、记忆成绩下降,并存在相关性。3.4结论:VD小鼠学习、记忆成绩下降可能与其海马JNK阳性锥体细胞水平增加有关。JNK阳性锥体细胞的增加是血管性痴呆小鼠学习、记忆成绩下降的分子学机制之一。多奈哌齐可以防止VD小鼠海马CAl区JNK阳性锥体细胞水平的上升,促进其学习和记忆成绩的改善。4 VD小鼠海马神经元ERK1及其ERK1 mRNA的变化及多奈哌齐的影响4.1目的:探讨VD小鼠海马神经元ERK1及其ERK1 mRNA的变化及多奈哌齐的影响。4.2方法:4.2.1动物分组与模型制备:将91例小鼠随机分为正常对照组（n=23）、假手术组（n=24）、VD模型组（n=21）、多奈哌齐组（n=23）)。采用双侧颈总动脉线结反复缺血再灌注法制备VD小鼠模型。利用跳台试验和水迷宫试验观测其行为学改变。4.2.2 ERK1测定方法:小鼠以10%水合氯醛麻醉,经灌注固定其脑组织,海马组织部位常规石蜡切片,应用IHC技术观察海马CA1区ERK1阳性锥体细胞的形态和分布,计算各切片海马CA1区ERK1染色阳性锥体细胞面密度值,应用ISH技术方法测定各组小鼠海马CA1区ERK1 mRNA表达阳性细胞的变化。4.3结果:4.3.1免疫组织化学技术4.3.1.1观测海马ERK1阳性细胞的形态和分布:在光镜下观察海马CA1区ERK1免疫反应主要在海马细胞的细胞膜和胞浆内表达。（1）正常组、假手术组海马CA1区ICH检查有正常的ERK1免疫反应阳性锥体细胞,排列正常,层次清楚,排列紧密,免疫反应阳性物质主要位于胞膜及胞浆内,呈棕色,胞体较大,圆形或椭圆形,染色较深。（2）模型组ERK1免疫反应阳性锥体细胞数目明显减少,ERK1免疫反应阳性神经元,胞体变小,排列稀疏,染色较淡。（3）多奈哌齐组的小鼠海马CA1区ERK1疫反应阳性锥体细胞数目增加,排列紧密,胞体变大。4.3.1.2观测海马ERK1阳性细胞数值结果:（1）与正常组的海马CA1区ERK1免疫反应阳性锥体细胞面密度值（21.21±9.15）和假手术组的ERK1免疫反应阳性锥体细胞面密度值（21.00±7.21）比较,VD模型组小鼠的ERK1免疫反应阳性锥体细胞面密度值（13.38±3.32）明显减少（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠的ERK1免疫反应阳性锥体细胞面密度值比较,多奈哌齐组小鼠的海马CA1区ERK1免疫反应阳性锥体细胞面密度值（23.31±13.26）明显增加（P<0.01）。4.3.1.3小鼠学习成绩和记忆成绩与ERK1免疫反应阳性细胞面密度值相关性分析:对小鼠各组海马ERK1免疫反应阳性锥体细胞面密度值与小鼠学习、记忆的各项参数进行相关性分析。ERK1免疫反应阳性锥体细胞面密度值减少,跳台试验小鼠反应时间延长,潜伏期缩短错误次数增多。水迷宫试验小鼠学习成绩中游完全程时间延长,错误次数增多,水迷宫试验小鼠记忆成绩中游完全程时间延长,即ERK1免疫反应阳性锥体细胞面密度值减少,小鼠学习、记忆成绩下降,并存在相关性。4.3.2原位杂交技术4.3.2.1观测其海马ERK1 mRNA阳性细胞的形态和分布:在光镜下观察海马CA1区ERK1 mRNA主要在海马细胞的细胞核和胞浆内表达。（1）正常组、假手术组海马CA1区ISH检查有正常的ERK1 mRNA表达阳性锥体细胞,排列正常,层次清楚,排列紧密,阳性物质主要位于胞核及胞浆内,呈棕色,胞体较大,圆形或椭圆形,染色较深。（2）模型组ERK1 mRNA阳性锥体细胞数目明显减少,胞体变小,排列稀疏,染色较淡。（3）多奈哌齐组的小鼠海马CA1区ERK1 mRNA表达阳性锥体细胞数目增加,排列紧密,胞体变大。4.3.2.2观测海马ERK1 mRNA阳性细胞数值结果:（1）与正常组的海马CA1区ERK1 mRNA阳性锥体细胞面密度值（34.79±21.10）和假手术组的ERK1 mRNA阳性锥体细胞面密度值（34.43±18.65）比较,VD模型组小鼠的ERK1 mRNA阳性锥体细胞面密度值（14.57±3.67）明显减少（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠的ERK1阳性锥体细胞面密度值比较,多奈哌齐组小鼠的海马CA1区ERK1 mRNA阳性锥体细胞面密度值ERK1 mRNA（28.38±15.66）明显增加（P<0.01）。4.3.2.3小鼠学习成绩和记忆成绩与ERK1 mRNA阳性锥体细胞面密度值相关性分析:对小鼠各组海马ERK1 mRNA阳性锥体细胞面密度值与小鼠学习、记忆的各项参数进行相关性分析。ERK1 mRNA阳性锥体细胞面密度值减少,跳台试验小鼠反应时间延长,潜伏期缩短错误次数增多。水迷宫试验小鼠学习成绩中游完全程时间延长,错误次数增多,水迷宫试验小鼠记忆成绩中游完全程时间延长,即ERK1 mRNA阳性锥体细胞面密度值减少,小鼠学习、记忆成绩下降,并存在相关性。4.4结论:证实了海马组织ERK1的减少与血管性痴呆小鼠学习、记忆成绩下降有关,多奈哌齐可以通过促进海马ERK1水平的上升,改善VD的学习、记忆成绩。5 VD小鼠海马神经元p38 MAPK及其p38 MAPK mRNA的变化及多奈哌齐的影响5.1目的:探讨VD小鼠海马p38 MAPK变化及多奈哌齐的影响。5.2方法:5.2.1动物分组与模型制备:将64例小鼠随机分为正常对照组（n=16）、假手术组（n=16）、VD模型组（n=16）、多奈哌齐组（n=16）。采用双侧颈总动脉线结反复缺血再灌注法制备VD小鼠模型。利用跳台试验和水迷宫试验观测其行为学改变。5.2.1 p38 MAPK测定:小鼠以10%水合氯醛麻醉,经灌注固定其脑组织,海马组织部位常规石蜡切片,应用IHC技术观察海马CA1区p38 MAPK阳性锥体细胞的形态和分布,计算各切片海马CA1区p38 MAPK阳性锥体神经细胞数值,应用ISH技术方法测定各组小鼠海马CA1区p38 MAPK表达阳性细胞的变化。5.3结果:5.3.1免疫组织化学技术5.3.1.1观测海马p38 MAPK阳性细胞的形态和分布:在光镜下观察海马CA1区p38 MAPK免疫反应主要在海马细胞的细胞膜和胞浆内表达。（1）正常组、假手术组海马CA1区ICH检查有正常的p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞,排列正常,层次清楚,免疫反应阳性物质主要位于胞膜及胞浆内,呈棕色,胞体较大,圆形或椭圆形,染色较淡。（2）模型组p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞数目明显增加,有大量p38 MAPK免疫反应阳性神经元,排列紧密,染色较深。（3）多奈哌齐组的小鼠海马CA1区p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞数目减少,层次尚清楚,染色较淡。5.3.1.2观测海马p38 MAPK阳性细胞面密度值结果:（1）与正常组的海马CA1区p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞面密度值（8.78±1.86）和假手术组的p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞面密度值（26.67±11.64）比较,VD模型组小鼠的p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞面密度值（71.11±27.96）明显增加（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠的p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞面密度值比较,多奈哌齐组小鼠的海马CA1区p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞面密度值（33.56±13.37）明显降低（P<0.01）。5.3.1.3小鼠学习成绩和记忆成绩与p38 MAPK免疫反应阳性细胞面密度值相关性分析:对小鼠各组海马p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞面密度值与小鼠学习、记忆的各项参数进行相关性分析。p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞面密度值增加,跳台试验小鼠反应时间延长,潜伏期缩短错误次数增多。水迷宫试验小鼠学习成绩中游完全程时间延长,错误次数增多,水迷宫试验小鼠记忆成绩中游完全程时间延长,即p38 MAPK免疫反应阳性锥体细胞面密度值增加,小鼠学习、记忆成绩下降,并存在相关性。5.3.2原位杂交技术5.3.2.1观测其海马p38 MAPK mRNA阳性细胞的形态和分布:在光镜下观察p38 MAPK mRNA主要在海马细胞核和浆表达。（1）正常组、假手术组海马CA1区ISH检查有正常的p38 MAPK mRNA表达阳性锥体细胞,排列正常,层次清楚,阳性物质主要位于胞核及胞浆内,呈棕色,胞体较大,圆形或椭圆形,染色较淡。（2）VD模型组ISH检查p38 MAPK mRNA表达阳性锥体细胞数目明显增加,有大量阳性神经元,排列紧密,染色较深。（3）多奈哌齐组的海马CA1区p38 MAPK mRNA表达阳性锥体细胞数目减少,层次尚清楚,染色较淡。5.3.2.2观测海马p38 MAPK mRNA阳性细胞面密度值结果:（1）与正常组的海马CA1区p38 MAPK mRNA阳性锥体细胞面密度值（12.44±5.46）和假手术组的p38 MAPK mRNA阳性锥体细胞面密度值（16.30±2.67）比较,VD模型组小鼠的p38 MAPK mRNA阳性锥体细胞面密度值（33.00±17.30）明显增加（P<0.01）。（2）与VD模型组小鼠的p38 MAPK mRNA阳性锥体细胞面密度值比较,多奈哌齐组小鼠的海马CA1区p38 MAPK mRNA阳性锥体细胞面密度值（17.78±6.53）明显降低（P<0.01）。5.3.2.3小鼠学习成绩和记忆成绩与p38 MAPK mRNA阳性细胞面密度值相关性分析:对小鼠各组海马p38 MAPK mRNA阳性锥体细胞面密度值与小鼠学习、记忆的各项参数进行相关性分析。p38 MAPK mRNA阳性锥体细胞面密度值增加,跳台试验小鼠反应时间延长,潜伏期缩短错误次数增多。水迷宫试验小鼠学习成绩中游完全程时间延长,错误次数增多,水迷宫试验小鼠记忆成绩中游完全程时间延长,即p38 MAPK mRNA阳性锥体细胞面密度值增加,小鼠学习、记忆成绩下降,并存在相关性。5.4结论:海马组织p38 MAPK的表达增加参与了VD的认知功能损害,VD小鼠海马p38 MAPK水平与其认知功能损伤有一定的相关性。多奈哌齐可以通过降低海马p38 MAPK表达,改善VD小鼠的学习、记忆成绩。