家蚕生物反应器表达人GM-CSF的研究

论文题目: 家蚕生物反应器表达人GM-CSF的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 陈健

导师: 张耀洲

关键词: 家蚕蛹,家蚕杆状病毒,表达,生物反应器

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是一种在体外调控粒细胞、单核／巨噬细胞分化、增殖和存活的造血性糖蛋白细胞因子。本研究成功地利用家蚕核型多角体杆状病毒表达系统在家蚕蛹中表达并纯化出重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。 通过RT-PCR技术，我们利用一对特异引物从人胚纤维原细胞中扩增到人GM-CSF基因。将扩增的GM-CSF PCR产物用EcoRI和BamHI酶切后插入到同样酶切的家蚕杆状病毒转移载体pUBM-4中，从而构成了重组载体pBM-CSF。将该质粒与线性化的Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞BmN，在培养的贴壁细胞中挑出空斑，经过3轮纯化，获得重组病毒vBm-CSF。 我们利用重组病毒vBm-CSF感染家蚕蛹来表达重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。经SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明在重组病毒感染的家蚕蛹体内存在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。表达产物分子量约为29kDa，在蚕蛹中的表达量约为97μg／蛹；在蚕蛹粗提物中的rhGM-CSF生物活性约为6.8×10~6cfu／mg。 与以前在家蚕细胞和幼虫中分泌表达的hGM-CSF相比，我们在家蚕蛹表达的hGM-CSF表现出较大的差异：分子量较大、表达量和生物活性偏低，这可能与蛋白的翻译后修饰有关。因而，有必要对蚕蛹表达的hGM-CSF进行大量表达和纯化以鉴定该表达产物的相关理化性质。为此，我们将重组病毒接种了大量的蚕蛹来表达hGM-CSF。通过硫酸铵分级沉淀、凝胶排阻过滤和离子交换层析多步纯化，最终我们以10.5％的得率从700头接种重组病毒的家蚕蛹中获得3.5mg纯度达97％的蚕蛹表达产物Bm-hGM-CSF。经检测，高纯度的表达产物Bm-hGM-CSF生物活性达约8.4×10~6cfs／mg。 对纯化的表达产物进行理化性质分析。等电聚焦电泳表明，家蚕蛹表达产物Bm-hGM-CSF等电点约为5.1，与家蚕细胞和幼虫中表达hGM-CSF很接近；肽谱分析发现，Bm-hGM-CSF与原核hGM-CSF在肽谱的表现上非常相似；去糖基化分析表明，Bm-hGM-CSF带有高甘露糖型糖链。这些情况表明，高度的高甘露糖化导致了Bm-hGM-CSF表现出较大差异。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

第一部分 文献综述

第一章 GM-CSF的研究进展

1.GM-CSF的染色体定位和基因组结构

2.GM-CSF基因的表达调控

3.GM-CSF的结构与功能

4.GM-CSF的生物学活性

5.GM-CSF在一些疾病的作用

5.1 GM-CSF在转基因动物疾病模型的作用

5.2 GM-CSF在肺泡蛋白沉积症中的作用

5.3 GM-CSF引起的炎症反应

5.4 GM-CSF佐剂的作用

5.5 宿主防御感染

第二章 昆虫杆状病毒表达载体系统研究进展

1.杆状病毒的生活循环

2.杆状病毒的基因及其功能

2.1 编码多角体有关的蛋白质的基因

2.2 编码病毒体结构蛋白基因

2.2.1 编码BV和PDV共有的结构蛋白的基因

2.2.2 BV特有的结构蛋白基因

2.2.3 PDV特有的结构蛋白基因

3.杆状病毒表达系统的建立及其原理

4.杆状病毒载体表达系统的改进

4.1 重组病毒分离和定量的改进

4.2 杆状病毒转移载体的改进

5.杆状病毒载体表达系统的特点

5.1 杆状病毒表达系统的优点

5.2 家蚕／BMNPV系统相对于SF细胞／AcNPV系统的优势

5.3 杆状病毒表达系统存在的缺陷

6.BESV的表达水平及其影响因素

第二部分 研究报告

第一章 实验设计方案

1.本研究的目的和意义

2.本研究的主要内容

3.实验流程

第二章 人GM-CSF在家蚕蛹中的表达、纯化和理化性质分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、菌种、病毒和载体

1.1.2 工具酶、试剂盒和其它生化试剂

1.2 方法

1.2.1 人GM-CSF基因的克隆

1.2.2 重组转移载体PBM-CSF的构建

1.2.3 重组病毒的构建与筛选

1.2.4 人GM-CSF在家蚕蛹中的表达和鉴定

1.2.5 家蚕蛹表达的RHGM-CSF大量纯化(所有操作在4℃条件下进行)

2 结果

2.1 HGM-CSF基因的克隆

2.1.1 总RNA的提取

2.1.2 HGM-CSF基因的克隆

2.2 重组转移载体的构建

2.2.1 转移载体PUBM-4的图谱

2.2.2 重组转移载体PBM-CSF的构建

2.2.3 重组转移载体PBM-CSF的鉴定

2.2.4 HGM-CSF基因序列分析

2.3 重组病毒的构建和筛选

2.3.1 病毒BM-BACPAK6 DNA的线性化

2.3.2 共转染及重组病毒的筛选

2.3.3 重组病毒的鉴定

2.3.3.4 重组病毒的滴度测定

2.4 人GM-CSF在蚕蛹中的表达和体外活性分析

2.4.1 HGM-CSF标准曲线绘制

2.4.2 RHGM-CSF在家蚕细胞中的表达与重组病毒滴度的关系

2.4.3 RHGM-CSF在家蚕蛹体内的表达时相

2.4.4 家蚕蛹表达的RHGM-CSF生物学活性的测定

2.4.5 RHGM-CSF的SDS-PAGE和WESTERN BLOTTING检测

2.5 蚕蛹表达人GM-CSF的纯化、理化性质和体外活性分析

2.5.1 硫酸铵分级沉淀

2.5.2 分子筛过滤

2.5.3 HIPREP Q FF柱层析

2.5.4 MONO Q柱层析

2.5.5 纯化样品的SDS-PAGE和WESTERN BLOTTING分析

2.5.6 纯化样品的纯度分析

2.5.7 家蚕表达的BM-RHGM-CSF纯化

2.5.8 BM-RHGM-CSF生物活性检测

2.5.9 BM-RHGM-CSF理化性质的分析

3 讨论

致谢

攻读博士学位期间的研究成果及发表的学术论文

发布时间: 2006-09-06

参考文献

• [1].基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究[D]. 岳万福.浙江大学2009
• [2].家蚕蛹表达人生长激素蛋白及其生物活性的研究[D]. 蓝航莲.浙江大学2009

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