淋球菌NspA重组蛋白诱导THP-1释放促炎细胞因子及细胞凋亡的作用

论文摘要

目的：构建pGEX-6p-1/nspA原核重组载体，表达并纯化GST-NspA重组蛋白，探讨NspA诱导人单核细胞（THP-1）产生炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和HMGB1的潜在能力及其诱导THP-1细胞凋亡程度的影响。方法：通过Genbank获取淋球菌NspA蛋白的基因序列，以WHO-E株全基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到目的片段，双酶切后连接到原核表达载体pGEX-6p-1质粒上，经测序鉴定后转化至表达宿主菌E.coli BL-21中，分别用IPTG浓度为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2mmol/L，在不同温度下（13℃、20℃、25℃、30℃、37℃）诱导蛋白表达；采用SDS-PAGE分析和Western blot鉴定表达产物，GST-Bind树脂柱纯化重组蛋白，经BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，用多粘菌素B去除纯化蛋白中的内毒素。以不同浓度NspA重组蛋白刺激THP-1分别作用不同的时长，采用ELISA法检测THP-1分泌促炎细胞因子HMGB1、IL-1β和TNF-α的水平。用不同浓度的NspA处理THP-1细胞，经AnnexinV-EGFP-PI双染法染色后，用荧光显微镜观测在不同刺激时间下的细胞凋亡形态上的变化，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：PCR扩增出淋球菌WHO-E株NspA基因目的片段，构建pGEX-6p-1/nspA原核重组载体，经酶切和测序鉴定证实与GenBank上GI：215260662序列完全一致。在IPTG浓度为0.8mmol/L、25℃诱导4.5h可得到重组表达菌表达NspA可溶性蛋白的最佳状态，获得了相对分子量约为44kDa的重组蛋白，选取菌体超声后的上清，经GST-Bind树脂柱亲和纯化后得到NspA纯化蛋白；经BCA试剂盒检测蛋白浓度为463μg/mL，经多粘菌素B处理重组蛋白去除内毒素后，鲎试验检测内毒素含量小于0.05EU/mL。2、4、8、16、32μg/mL的NspA重组蛋白均能诱导THP-1产生不同水平的IL-1β、TNF-α和HMGB1，并呈剂量依赖性，同时也随着刺激时长的增加而变化。NspA的刺激浓度在8μg/mL作用48h时，TNF-α的量达到138pg/mL的峰值，与PBS/GST对照组及其它各平行组之间比较均有显著差异（P<0.05）。在NspA刺激浓度4μg/mL作用时长24h时、8μg/mL刺激48h时，IL-1β分别达到约56pg/mL的峰值，与PBS/GST对照组及其它各平行组之间比较均有显著差异（P<0.05）。HMGB1的分泌量随时间的延长而增加，在NspA刺激60h时，HMGB1的分泌量达到峰值，与PBS/GST对照组及其它各平行组之间比较均有显著差异（P<0.05）。用4、8、16、32、64μg/mL NspA重组蛋白刺激THP-1细胞作用不同的时间梯度，经AnnexinV-EGFP-PI双染法染色后荧光显微镜观察，随着作用时间的延长及蛋白刺激浓度的升高，凋亡的细胞明显增多。通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果显示随着作用时间的延长及蛋白刺激浓度的升高，细胞凋亡百分率有明显的变化，在刺激蛋白浓度为16μg/mL作用24h的时候凋亡百分率达到峰值为18.27%，与PBS/GST对照组及其它各平行组比较均有显著差异（P<0.05）。结论：1.成功构建了pGEX-6p-1/NspA原核表达载体，制备出可溶性的高纯度NspA重组蛋白。2. NspA重组蛋白能促进THP-1细胞分泌炎症因子IL-lβ、TNF-α、HMGB1。3. NspA重组蛋白能诱导THP-1细胞发生凋亡。

论文目录

• 主要缩略语英文索引
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 文献综述
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢