小鼠MT/αα基因转入水生美人蕉的研究

论文摘要

美人蕉生长强健,生态幅度广,我国南北各地都能适应,从热带、亚热带至温带地区均有栽培。哺乳动物的金属硫蛋白（Metallothionein,简称MT）是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,在动物体内主要参与必需金属离子的代谢和有毒重金属的解毒等过程。小鼠MT-Ⅰ具有α和β两个结构域,这两个结构域在结构和功能上既相互联系又各有分工,并且对重金属具有不同的亲和力,其中α结构域优先结合Cd2+、Hg2+等,而β结构域优先结合Cu2+、Zn2+等。本研究以水生美人蕉为材料,采用农杆菌介导法,开展了小鼠金属硫蛋白基因（MT）及其突变体αα基因的遗传转化研究,利用它们结合并解毒重金属的特性,提高美人蕉对Cd等重金属的抗性和积累能力,从而开发出新型植物,用于环境重金属污染的生态修复。无菌苗的制备:以取回的野外水生美人蕉为材料,清洗干净,后用流动的自来水冲洗20min左右,切取长为1-2cm的芽苞,在无菌环境下用75%的乙醇浸30秒,再用0.1%HgCl2处理10min左右,无菌水冲洗4-6次后,切取5mm3左右带有3-4个叶原基的茎尖作为外植体,接种于适当的培养基上。组织培养:以水生美人蕉为试材,将水生美人蕉不同的外植体接种于不同基本培养基和添加不同激素种类及其浓度配比的培养基中培养,研究丛生芽及愈伤组织的诱导条件。结果表明:茎尖生长点和花梗为适宜的组培器官;茎尖成苗率最高的激素组合是NAA0.1mg/L与6-BA2.0mg/L和3.0mg/L;苗平均高度最高的培养基配方是6-BA 2.0mg/L、3.0mg/L与NAA0.5mg/L的组合;美人蕉不定芽增殖最优培养基为MS+6-BA 8mg/L+NAA 0.1mg/L。遗传转化中选择压力的确定:本研究构建的植物表达载体以抗除草剂抗性（bar）基因和新霉素磷酸转移酶（npt-Ⅱ）基因为标记基因,因此可用PPT和Kan作为转化植株的筛选压力。本实验对美人蕉的卡那霉素抗性作了较系统的研究,发现随着Kan浓度的提高,子叶白化率升高、根茎变短、鲜重减轻。在30 mg/L的处理中,生长20天的白化苗率达到100%。美人蕉的卡那霉素抗性检测为遗传转化和阳性后代筛选奠定了基础。遗传转化体系的优化:以水生美人蕉生长点为材料,研究了农杆菌介导的水生美人蕉生长点转化体系的几个因素。得出最优转化条件是:菌液浓度OD600=0.3-0.5左右,菌液中加入100μmol/L AS ,浸染时间10-15min,共培养3天。通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）浸染水生美人蕉生长点的方法,将MT（αα）基因导入美人蕉中,在含有Kan的培养基上筛选,获得抗性植株。该方法不需要经过愈伤组织阶段而直接从生长点生成丛生芽,在所有的转化实验中,共浸染了281个生长点,并筛选到25株抗性植株。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第一节 水生美人蕉简介
• 1 形态特征和生物学特性
• 2 繁殖方法
• 3 栽培管理
• 4 美人蕉的应用价值
• 第二节 金属硫蛋白简介
• 1 MT 的分子结构
• 2 MT 的生物学特性
• 3 MT 的功能
• 第三节 环境中重金属污染治理方法研究进展
• 1 化学修复
• 2 物理修复
• 3 生物修复
• 第四节 农杆菌介导植物基因转化的研究进展
• 1 土壤农杆菌基因转化系统的优缺点
• 2 土壤农杆菌介导转化的步骤
• 3 土壤农杆菌介导单子叶植物基因转化的可行性
• 4 影响农杆菌转化单子叶植物的因素
• 第五节 研究目的和意义
• 第二章 美人蕉的组织培养
• 1 试验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 卡那霉素对美人蕉影响的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第四章 农杆菌介导的基因转化
• 1 试验材料
• 2 试验方法
• 3 试验结果及分析
• 4 讨论
• 第五章 转基因植株的分子检测
• 1 实验材料
• 2 试剂配制方法
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 第六章 主要结论和下一步工作
• 1 主要结论
• 2 下一步工作建议
• 参考文献
• 附录
• 致谢