油茶泛素结合酶E2基因全长cDNA克隆及其RNAi干扰载体的构建

油茶泛素结合酶E2基因全长cDNA克隆及其RNAi干扰载体的构建

论文摘要

油茶(Camellia oleifera)是一种多年生木本科油料作物,是我国重要的木本食用油料树种。茶油主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸组成,其含量一般在90%以上,是当前国内最受欢迎的高营养价值的食用油之一。由于油茶种子的发育过程处于南方高温、干旱天气,土壤贫瘠等生理环境,因此油茶在生长发育过程中,会遭受到一些非生物胁迫,如干旱、重金属、营养缺乏、高盐,病虫害、高温或低温等。介导蛋白质特异降解的泛素/26S蛋白酶体途径显著影响着植物的生长发育,泛素结合酶E2作为该途径中的一个关键酶,对植物的细胞周期调控、植物衰老、细胞分化、激素信号响应、光形态建成及非生物胁迫响应等产生了重要的影响。本研究在已有的油茶种子cDNA文库及EST文库的基础上,对油茶E2基因进行全长cDNA的克隆和生物信息学分析,并构建了植物RNAi干扰载体。主要研究结果如下:1、油茶E2基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析。从本实验室油茶cDNA文库中鉴定出一条E2基因的全长cDNA,该基因长度为804bp,经与核酸数据库进行比对分析,确定为E2基因,该基因编码152个氨基酸。应用一系列生物信息学分析方法对其等电点、分子量、跨膜结构、疏水性、二级结构等进行预测分析,结果显示:E2蛋白质的分子量为17.4KDa,等电点为5.40。E2整个蛋白的疏水指数从-3.633到2.122,其中除在37位、102位以及105位氨基酸表现出疏水性,整条多肽链表现出亲水性。E2蛋白有两个不明显的跨膜区。二级结构预测发现油茶E2蛋白二级结构以α螺旋结构为主,不规则卷曲散布于整个蛋白质中。油茶E2蛋白第77~92位为泛素结合酶活性位点,其中活性位点中的半胱氨酸位于第88位。2、油茶E2基因的RNAi干扰载体构建。采用片段替换方法构建了中间载体pMD19-Dimer。根据油茶E2基因的序列特点,设计引物克隆了RNAi干扰载体片段。将干扰片段依次插入到中间载体pMD19-Dimer上。检测RNAi中间载体构建成功后,用引物XbaⅠ和SacⅠ分别双酶切pMD 19-Dimer-E2-RNAi和植物载体pBI121,回收连接,构建植物干扰载体pBI-E2-RNAi。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词
  • 1 绪论
  • 1.1 油茶的概述
  • 1.2 油茶的育种与栽培研究
  • 1.3 油茶的分子生物学与细胞生物学的研究进展
  • 1.3.1 油茶的分子标记研究
  • 1.3.2 油茶的cDNA文库和EST文库的构建
  • 1.4 泛素-26S蛋白酶体途径
  • 1.5 泛素化过程
  • 1.5.1 泛素(Ubiquitin,Ub)
  • 1.5.2 泛素连接级联反应
  • 1.5.3 26S蛋白酶体
  • 1.5.4 去泛素化酶(deubiquitination enzymes,DUBs)
  • 1.6 泛素/26s蛋白酶体途径的生理功能
  • 1.6.1 泛素/26s蛋白酶体途径与生长素响应
  • 1.6.2 泛素/26s蛋白酶体途径与光形态建成
  • 1.6.3 泛素/26s蛋白酶体途径与非生物胁迫抗性
  • 1.7 泛素结合酶E2的研究进展
  • 1.7.1 泛素结合酶E2的属性与分类
  • 1.7.2 泛素结合酶E2功能的研究进展
  • 1.8 本研究的意义、主要内容和技术路线
  • 2 油茶泛素结合酶E2基因克隆与序列分析
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 材料
  • 2.1.2 方法
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 目的基因的PCR检测
  • 2.2.2 油茶泛素结合酶基因全长cDNA克隆及序列分析
  • 2.2.3 油茶E2蛋白质理化性质分析
  • 2.2.4 油茶E2蛋白质高级结构预测
  • 2.3 讨论
  • 3 油茶E2基因RNAI载体的构建
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 实验方法
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 RNAi载体干扰片段的制备
  • 3.2.2 中间载体pMD19-Dimer的构建
  • 3.2.3 中间载体pMD19-Dimer-E2-RNAi的构建
  • 3.2.4 油茶E2基因RNAi载体的构建
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 目的片段引物的设计和克隆
  • 3.3.2 中间载体的改造
  • 3.3.3 RNAi干扰载体的构建
  • 4 结论与创新
  • 4.1 结论
  • 4.2 创新点
  • 参考文献
  • 附录A:主要试剂的配制
  • 附录B:攻读学位期间的主要学术成果
  • 致谢
  • 相关论文文献

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