论文摘要
14-3-3zeta蛋白是14-3-3蛋白家族中的一个成员，通常以二聚体的形式存在。14-3-3蛋白是真核细胞中普遍存在的高度保守的蛋白家族，由7个亚型组成。14-3-3zeta蛋白能够同时结合两个配体，是信号传导通路中的重要接头蛋白。14-3-3zeta蛋白可以和受体、激酶等多种配体结合，通过相互作用调节它们的生物学活性。14-3-3蛋白是一种重要的抑制凋亡因子，近年来的研究表明14-3-3zeta与糖尿病肾病、抑郁症、老年性痴呆病等多种疾病有关，但其相关机理仍未完全阐明。有关报道显示14-3-3zeta蛋白在乳腺癌、肝癌中过量表达，可能成为肿瘤诊断中的一种新型潜在标记物制备14-3-3zeta特异性抗体将为14-3-3zeta蛋白功能的深入研究和肿瘤诊断提供有利的工具。14-3-3蛋白家族高度保守，各亚型之间的同源性超过70％。目前所报道的14-3-3zeta抗体均未对14-3-3蛋白的7个亚型进行特异性鉴定，无法说明它的特异性。本论文旨在制备抗14-3-zeta蛋白的特异性抗体。为此，我们从以下几个方面进行了研究。（1）14-3-3zeta合成多肽抗原的制备：通过生物信息学14-3-3zeta蛋白氨基酸序列的同源性、疏水性、抗原决定簇等进行分析。通过对分析的结果进行处理，最终确定14-3-3zeta蛋白二序列位置为230-240的DTQGDEAEAG氨基酸序列为免疫肽段。该段多肽的特异性较大，亲水性较强，但免疫原性一般。为增强该肽段的免疫原性，将其铰链在BSA上，获得合成抗原。（2）14-3-3zeta重组抗原的制备：以质粒pDEST17为表达载体，在大肠杆菌中诱导表达14-3-3zeta基因融合蛋白的表达，通过His-镍亲和基质纯化14-3-3zeta蛋白。再通过非变性梯度凝胶电泳对洗脱后的14-3-3zeta蛋白进一步纯化和除盐。对含有目标蛋白的凝胶进行切割处理。冷冻干燥后碾成粉末，作为重组蛋白抗原。（3）14-3-3zeta蛋白多克隆抗体的制备：分别利用14-3-3zeta蛋白C端合成多肽以及14-3-3zeta重组蛋白作为抗原，对纯种新西兰兔进行免疫，获得了兔抗人14-3-3zeta蛋白的抗血清。用诱导后的BL21／pDEST17-14-3-3zeta对两种抗血清进行效价测定。Western blot测定表明兔抗14-3-3zeta蛋白抗体的效价为1：500，而兔抗14-3-3zeta多肽抗体的效价为1：400。（4）14-3-3zeta抗体的特异性检测：现有构建好的质粒pDEST17-14-3-3-beta、pDEST17-14-3-3-gamma、pDEST17-14-3-3-epsilon、pDEST17-14-3-3-eta、pDEST17-14-3-3-zeta、pDEST17-14-3-3-tau和pDEST17-14-3-3-sigmmar，经BL21（DE3）诱导表达后，分别用商品化的兔抗His抗体、自制的兔抗zeta蛋白抗体及自制的兔抗zeta蛋白C端多肽抗体标记。实验结果表明兔抗zeta蛋白C端多肽抗体具有特异性，仅识别zeta亚型；而兔抗zeta蛋白抗体可以结合zeta，tau，gamma三种亚型。（5）抗14-3-3zeta多肽抗体的免疫细胞分析：分别将真核表达空质粒pcDNA3和重组质粒pDEST26-14-3-3zeta转化到哺乳动物细胞cos7，通过自制的抗14-3-3zeta蛋白C端多肽抗体标记转染后的细胞，实验结果表明该抗体可以识别天然的14-3-3zeta蛋白，14-3-3zeta蛋白分布在cos7细胞质的一侧。以上研究结果初步证明：抗14-3-3zeta多肽抗体具有特异性，仅结合14-3-3zeta亚型且能够识别14-3-3zeta蛋白的天然构象。以上的研究对14-3-3zeta蛋白的功能进一步研究与肿瘤诊断提供了有利的工具。
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