人t-PA指形区缺失体乳腺特异性表达载体的构建及细胞表达研究

论文摘要

本研究以奶牛β-酪蛋白基因调控区为指导元件,以人组织型纤溶酶原激活剂指形区缺失体（t-PA 指形区缺失体）为表达序列,构建了乳腺特异性表达载体pEBT。转染牛耳成纤维细胞,筛选获得稳定表达株。在载体pEBT 的基础上,加入牛乳腺核基质附着区（BMARs）和人α-丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的核基质附着区（HMARs）,构建成另外两个t-PA 指形区缺失体乳腺特异性表达载体pBEBT 和pHEBT。为利用体细胞核移植技术生产牛乳腺生物反应器,提供高效表达t-PA 指形区缺失体的细胞株。相关结果如下:　　1.　通过RT-PCR 技术成功的从人胎盘组织中扩增出长度为1　640　bp 的人t-PA　指形区缺失体cDNA,其中包含完整的编码序列。序列分析表明,片段与GenBank 中登录的人t-PA 指型区缺失区体cDNA 序列的同源性为99%。在读码框内,只有三个碱基发生点突变。分析表明,但这三处突变不影响蛋白质功能。　2.　利用定向克隆的方法,将t-PA 指形区缺失体表达序列与改造好的初级乳腺表达载体pBCP 融合在一起,然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1 中,最终构建了t-PA 指形区缺失体乳腺特异性表达载体pEBT。载体含有抗性基因和绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因,并保证报告基因和目的基因表达为非融合型表达。　3.　通过脂质体法将表达载体pEBT 转入体外培养的牛耳成纤维细胞,经G418 抗性筛选,得到的阳性细胞可稳定地表达绿色荧光蛋白,但表达量偏低。通过PCR 检测,表明t-PA 指形区缺失体cDNA 序列已整合到牛耳成纤维细胞染色质中。　4.　利用PCR 技术扩增了牛乳腺核基质附着区,全长1　190　bp。序列分析表明,所克隆的片段与GenBank 中登录的牛乳腺核基质附着区的同源性为99　%,通过在线软件进行功能分析,证明该片段含有AT-Richness　Pattern　、ORI　Pattern、ATC　Rule　等重要的功能区。　5.　将牛乳腺核基质附着区（BMARs）定向克隆至pEGFP-C1 载体中EGFP 的下游,构成重组载体pBE。并在牛乳腺核基质附着区的上游引入终止密码子TAA,确保表达的EGFP为非融合蛋白。将pBE 载体转染分离培养的牛耳成纤维细胞,经G418 抗性筛选后得到的稳定克隆在荧光显微镜下观察,表明BMARs 确实可提高基因的表达效率。　6.　以重组表达载体pBE 和pHE（pEGFP-C1-HMARs）为基础构建了t-PA 指形区缺失体乳

论文目录

• 文献综述
• 第一章 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展
• 1.1 基于乳蛋白调控序列的表达载体的构建
• 1.1.1 乳蛋白调控序列
• 1.1.2 提高外源基因表达效率的辅助元件
• 1.1.3 目的基因
• 1.2 基因转移技术
• 1.2.1 显微注射法
• 1.2.2 精子载体法
• 1.2.3 胞内精子注射法（ICSI）
• 1.2.4 胚胎干细胞介导法
• 1.2.5 逆（反）转录病毒介导法
• 1.2.6 受体介导的基因转移
• 1.2.7 体细胞核移植介导法
• 1.3 基于人工染色体的表达载体
• 1.4 体细胞基因打靶制备动物乳腺生物反应器
• 1.4.1 体细胞基因打靶的技术优势
• 1.4.2 体细胞基因打靶的策略
• 1.4.3 体细胞核移植现存的技术难点
• 1.4.4 体细胞基因打靶是制备乳腺生物反应器的必然趋势
• 1.5 存在的问题与产业化前景
• 试验部分
• 第二章 人t-PA指形区缺失体基因cDNA的克隆及序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 人胎盘组织总RNA的完整性
• 2.2.2 t-PA指形区缺失体cDNA序列的扩增结果
• 2.2.3 重组质粒酶切鉴定结果
• 2.2.4 序列分析结果
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 牛β-酪蛋白基因的克隆及序列测定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 试验结果
• 3.2.1 CN1、CN2和CN3的PCR扩增结果
• 3.2.2 重组质粒酶切鉴定结果
• 3.2.3 序列分析结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 第四章 牛乳腺核基质附着区的克隆及其功能研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 BMARsPCR扩增结果
• 4.2.2 重组质粒pBM的酶切鉴定结果
• 4.2.3 BMARs的测序及分析结果
• 4.2.4 重组质粒pBE的鉴定结果
• 4.2.5 牛耳成纤维细胞的体外培养生长特点
• 4.2.6 细胞G418抗性筛选
• 4.2.7 转染后的成纤维细胞GFP的检测
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 第五章 人t-PA指形区缺失体乳腺表达载体的构建及其在成纤维细胞中的表达
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 重组质粒pBT的鉴定结果
• 5.2.2 人t-PA指形区缺失体乳腺表达载体的鉴定结果
• 5.2.3 转染后的成纤维细胞GFP的检测
• 5.2.4 阳性细胞的PCR鉴定
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介