刺参腐皮综合症病原菌及其裂解性噬菌体的分离和鉴定

论文摘要

“腐皮综合症”是刺参养殖中最常见,危害最为严重的疾病。当前,“腐皮综合症”的防治主要依赖消毒剂和抗生素,传统抗生素类药物的滥用易导致细菌抗药性的产生和药物残留等食品安全问题,因此急需研发一种新的防治刺参细菌性疾病的抗菌制剂。本实验拟从患“腐皮综合症”的刺参中分离一株致病菌,通过人工回接感染实验、生理生化指标和分子生物学手段鉴定该菌株；在此基础上以该致病菌为宿主菌筛选裂解性噬菌体,并考察噬菌体的生物学特性。将患有“腐皮综合症”的刺参组织匀浆并稀释,涂布于选择性培养基中培养,挑取优势菌落培养、纯化后保存；经人工回接感染实验验证所得菌株的致病性；通过形态学、生理生化指标以及16S rDNA PCR技术分析鉴定该病原菌的种属。实验结果表明,分离纯化后的优势菌落颜色为玉米黄色,扁平且呈煎蛋型,不透明,无气味,不易挑起,菌落光滑且富有粘性,为革兰氏阴性短杆弧形,长约1～2μm,具有极生单鞭毛,其扫描电镜形态与弧菌属的形态特征相近。人工回接感染实验结果显示,体腔注射攻毒菌体剂量为5x103CFU可导致刺参吐肠；将刺参浸浴在菌体浓度为1×103CFU/ml的水体中,饲养第3天可引起刺参腐皮综合症的爆发。分离的致病菌能够分解代谢精氨酸、葡萄糖苷、苯丙氨酸、甘氨酸,不能分解代谢尿素、丙二酸、果糖、鸟氨酸、山梨醇及乙酸,与哈维氏弧菌的代谢特征极其相似。进一步将PCR扩增获得的16S rDNA片段（1436bp）进行系统发育树分析表明与哈维氏弧菌同源性可达99%。采集刺参养殖场的废水,经离心、过滤处理得到噬菌体原液；将噬菌体原液接种到上述分离的对数生长期菌液中培养,过滤除菌,得到高效价噬菌体增值液。通过双层平板法分离纯化噬菌体。透射电镜观察噬菌体的形态特征,RFLP分析噬菌体基因组的指纹图谱,通过体外抑菌实验、一步生长曲线、宿主菌对噬菌体抗性研究以及噬菌体颗粒浓缩来阐述噬菌体的生物学特性。实验结果表明双层平板法获得大小不同的两种噬菌斑。透射电镜观察结果显示,分离的两株噬菌体（VP-1和VP-2）属于长尾噬菌体科（Siphoviridae）。RFLP实验表明,VP-1和VP-2的基因组为双链DNA。VP-2噬菌体的裂解周期为40min,一个裂解周期可以产生约100个子代噬菌体颗粒。宿主菌对VP-1和VP-2均能产生抗性,VP-1的裂解能力优于VP-2, VP-1和VP-2协同作用时,可以显著抑制病原菌的生长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 刺参简介
• 1.1.1 刺参分布
• 1.1.2 营养价值与药用价值
• 1.1.3 刺参养殖业发展及面临问题
• 1.1.4 腐皮综合症发病症状及原因
• 1.1.5 水产动物细菌性疾病生物防治手段
• 1.2 噬菌体简介
• 1.2.1 噬菌体分类
• 1.2.2 噬菌体治疗发展史
• 1.2.3 噬菌体的作用过程
• 1.2.4 噬菌体的作用特点
• 1.2.5 噬菌体在海洋生态系统的作用
• 1.3 噬菌体治疗在水产中的应用
• 1.4 裂解性噬菌体防治刺参腐皮综合症
• 1.4.1 噬菌体给药剂型和给药途径
• 1.4.2 刺参体内免疫系统对噬菌体治疗作用效果的影响
• 1.4.3 水体环境中噬菌体与浮游微生物的种群数量关系及消长规律
• 1.4.4 噬菌体在水产动物体内的吸收分布过程及药代动力学特征
• 1.4.5 噬菌体防治刺参腐皮综合症的优势
• 1.4.6 噬菌体治疗不可忽略的问题
• 1.5 本论文研究意义
• 1.6 本论文的研究思路
• 1.7 噬菌体治疗展望
• 2 致病菌的分离纯化及鉴定
• 2.1 实验用品
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂与药品
• 2.1.3 实验仪器与设备
• 2.1.4 培养基的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病灶处优势菌的分离纯化
• 2.2.2 菌种保藏
• 2.2.3 致病菌的人工回接感染实验
• 2.2.4 扫描电镜观察致病菌
• 2.2.5 致病菌BD生理生化指标鉴定
• 2.2.6 致病菌分子指标鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 分离纯化结果
• 2.3.2 人工回接感染实验结果
• 2.3.3 致病菌鉴定结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 裂解性噬菌体的分离与鉴定
• 3.1 实验用品
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂与药品
• 3.1.3 实验仪器与设备
• 3.1.4 培养基及试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 噬菌体的分离及纯化
• 3.2.2 氯仿敏感性测试
• 3.2.3 噬菌体透射电镜观察
• 3.2.4 体外抑菌实验
• 3.2.5 噬菌体颗粒的浓缩
• 3.2.6 一步生长曲线
• 3.2.7 噬菌体DNA的提取和限制性内切酶酶切分析（RFLP）
• 3.2.8 噬菌体蛋白的提取和SDS-PAGE分析
• 3.2.9 细菌对噬菌体抗性的初步分析实验
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 噬菌体分离结果
• 3.3.2 噬菌体纯化结果
• 3.3.3 噬菌体对氯仿敏感性测定结果
• 3.3.4 噬菌体透射电镜观察结果
• 3.3.5 体外抑菌实验结果
• 3.3.6 一步生长曲线
• 3.3.7 噬菌体DNA的提取和限制性内切酶酶切分析（RFLP）
• 3.3.8 噬菌体蛋白的提取和SDS-PAGE分析
• 3.3.9 细菌对噬菌体抗性结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 缩写
• PCR 测序结果
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢