载金属离子氨基多糖纳米微粒的抗菌作用及其对大鼠免疫功能的影响

论文摘要

抗生素在畜牧生产中的长期广泛使用,引起了细菌耐药性的产生,并导致药物在畜产品中残留以及威胁生态环境等问题,并给人类的健康带来直接或者间接地威胁,因此,其使用受到广泛地质疑。所以,研制和开发安全无公害的抗生素替代品已迫在眉睫。本课题以天然氨基多糖为基础材料,运用纳米技术,构建了氨基多糖纳米微粒,并对其结构和性质以及吸附性能进行了研究,进而在此基础构建了分别载有不同金属离子的氨基多糖纳米微粒,从中筛选出具有高效杀菌活性的载铜氨基多糖纳米微粒（APN）,并通过动物实验,研究了其在大鼠上的使用效果,旨在研究和探讨APN的应用效果及其在动物体内的生物学效应,为APN的深入研究和推广应用提供科学依据。主要研究结果如下：1.氨基多糖纳米微粒是大小均一、形状规则的球体,其平均粒径53.99nm,Zeta电位+51.37mV,属于零位纳米材料,即纳米微粒；该纳米微粒对染料伊红Y具有很高的吸附性能,最大吸附量3.333 g/g,吸附过程符合Langmuir方程。2.与氨基多糖纳米微粒相比,载有不同金属离子（载Ag+、载Cu2+、载Zn2+载Mn2+、载Fe2+）之后,粒径增大,Zeta电位升高,且杀菌活性与载金属离子材料本身的Zeta电位呈正相关。体外试验结果表明,载银离子的氨基多糖纳米微粒具有最高的杀菌活性,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度（MBC）分别为6μg/ml和12μg/ml；载铜离子的氨基多糖纳米微粒次之,最小杀菌浓度（MBC）分别为12lμg/ml和24μg/ml；其后依次是载Zn2+的氨基多糖纳米微粒（24μg/ml和48μg/ml）,载Mn2+的氨基多糖纳米微粒（97μg/ml和97μg/ml）,载Fe2+的氨基多糖纳米微粒效果最差（195μg/ml和195μg/ml）与氨基多糖纳米微粒相差不大（187μg/ml和281μg/ml）。3.APN是大小均一形状规则的球体,其粒径和Zeta电位分别为121.90nm和+88.69 mV。体外试验结果表明,APN对大肠杆菌K88和猪霍乱沙门氏菌的最小杀菌浓度为12μg/ml。原子力显微镜下动态观察APN作用下大肠杆菌K88的形态变化,结果发现,大肠杆菌K88的细胞膜被破坏,在表面出现孔洞,故推测细胞膜可能是APN的作用位点,而膜破裂内容物外泄导致细菌死亡则可能是其主要杀菌机理。4.选取平均体重85±2g的雄性SD大鼠,每天分别口服80mg/kg b.w.和160mg/kg b.w.的APN,21天后发现,与对照组相比,大鼠的日增重分别提高了8.5%（P<0.05）和14.1%（P<0.05）,饲料转化效率分别提高了17.2%（P<0.05）和22.5%（P<0.05）；血清指标的测定结果表明,血清总蛋白浓度分别提高了18.4%（P<0.05）和30.2%（P<0.05）,尿素氮浓度分别降低了41.0%（P<0.05）和52.3%（P<0.05）；血清中IgA的浓度分别提高了32.9%（P<0.01）和39.7%（P<0.01）,IgG的浓度提高了64.1%（P<0.01）和108.9%（P<0.01）；补体C3的浓度分别提高31.7%（P<0.05）和48.8%（P<0.05）；而血清溶菌酶的水平则分别是对照组的5.3倍（P<0.01）和6.0倍（P<0.01）。外周血淋巴细胞和脾脏淋巴细胞培养转化试验的结果表明,ConA和LPS诱导下,刺激指数（SI）分别提高了8.8%（P>0.05）、23.4%（P<0.05）和12.8%（P>0.05）和21.1%（P<0.05）,提示APN显著增强了大鼠的免疫功能。5.进一步研究得知,APN显著改变了大鼠盲肠菌群的组成,与对照组相比,盲肠内容物中乳酸菌和双歧杆菌数显著升高（P<0.05）,而总需氧菌、总厌氧菌、大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌数均显著低于对照组（P<0.05）；APN显著提高了细菌酶α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶和α-葡萄糖苷酶的活性（P<0.05）,提示了微生物消化功能的增强,而β-葡萄糖苷酸酶的活性比对照组降低了（P<0.05）,提示病原菌数量减少；APN显著提高了盲肠内容物中丙酸和丁酸的浓度（P<0.05）,同时显著降低了盲肠内容物的pH（P<0.05）。APN明显地改善了大鼠小肠粘膜的形态结构,使得绒毛变长（P<0.05）,隐窝变浅（P<0.05）；同时,提高了小肠粘膜二糖酶（蔗糖酶、麦芽糖酶和乳糖酶）的活性。APN提高了小肠内容物中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性,分别提高了17.26%（P<0.05）和25.34%（P<0.05）、33.04%（P<0.05）和59.06%（P<0.05）、32.65%（P<0.05）和45.92%（P<0.05）。

论文目录

致谢

中文摘要

ABSTRACT

主要缩写词

引言

第一篇文献综述

第一章饲用抗生素面临的挑战及替代品的研究进展

1 抗生素生长促进剂的历史

2 抗生素在畜牧生产中的积极作用

3 抗生素生长促进剂引起的问题

3.1 破坏肠道微生态平衡

3.2 抑制机体免疫功能

3.3 药物残留

3.4 耐药性的产生

4 抗生素生长促进剂面临的挑战

5 抗生素替代品的研究进展

5.1 益生元（Probiotics）

5.2 中草药饲料添加剂

5.3 寡聚糖

5.4 其它抗生素替代品

第二章氨基多糖的研究现状

1 氨基多糖的发现

2 甲壳素在自然界的分布

3 甲壳素的制备及其理化性质

4 氨基多糖的制备及理化性质

5 氨基多糖的应用

5.1 工业废水处理

5.2 氨基多糖在医药领域的应用

5.3 氨基多糖在食品工业中的应用

第三章纳米技术的发展及在生命科学中的应用

1 纳米技术相关的概念

2 纳米粒子的特性

2.1 表面效应

2.2 小尺寸效应

2.3 量子尺寸效应

2.4 宏观隧道效应

3 纳米材料的制备方法

3.1 物理方法

3.2 化学方法

4 目前世界各主要国家纳米技术的研究概况

4.1 美国

4.2 欧洲和日本

4.3 中国

5 纳米技术在生物科学领域中的研究进展

5.1 纳米抗菌剂的研究进展

5.2 纳米技术在药物学上的研究进展

5.3 纳米技术在基因治疗中的研究进展

5.4 纳米科技在畜牧业中的应用

第二篇体外试验

第四章氨基多糖纳米微粒的表征及吸附特性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 粒径和Zeta电位分析

1.3 氨基多糖纳米微粒的形态

1.4 吸附试验

1.5 吸附等温线

1.6 吸附热力学参数

1.7 数据处理

2 结果与讨论

2.1 粒径

2.2 Zeta电位

2.3 氨基多糖纳米微粒的形态

2.4 起始浓度和接触时间对吸附的影响

2.5 介质pH值对吸附的影响

2.6 温度对吸附的影响

2.7 吸附等温线

3 小结

第五章载不同金属离子氨基多糖纳米微粒的杀菌活性研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 材料特性分析

1.3 细菌悬液的制备

1.4 最小抑菌浓度（MIC）

1.5 最小杀菌浓度（MBC）

1.6 数据处理

2 结果与讨论

2.1 载不同金属离子的氨基多糖纳米微粒的特性

2.2 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）

3 小结

第六章 APN的杀菌活性及机理研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 APN的形态观察

1.3 细菌悬液的制备

1.4 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）

1.5 抑菌曲线和杀菌曲线

88形态变化的动态观察'>1.6 大肠杆菌K₈₈形态变化的动态观察

1.7 数据处理

2 结果和讨论

2.1 APN的形态

2.2 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）

2.3 APN的抑菌活性

2.4 APN的杀菌活性

2.5 APN杀菌过程中细菌的形态变化

3 小结

第三篇饲养试验

第七章 APN对大鼠生长、血清指标及免疫功能的影响

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 试验设计与饲养管理

1.3 屠宰和取样

1.4 外周血淋巴细胞转化试验

1.5 脾脏淋巴细胞转化试验

1.6 血清相关指标的测定

1.7 数据统计和分析

2 结果

2.1 生长性能和饲料转化效率

2.2 SD大鼠血清相关指标

2.3 SD大鼠血清免疫球蛋白、补体和溶菌酶水平

2.4 SD大鼠外周血和脾脏淋巴细胞转化率

3 讨论

3.1 生长性能与饲料转化率

3.2 血清相关指标的变化

3.3 大鼠血清免疫球蛋白、补体和溶菌酶水平的影响

3.4 SD大鼠外周血和脾脏淋巴细胞转化率

4 小结

第八章 APN对大鼠盲肠菌群、细菌酶活性和短链脂肪酸浓度的影响

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 试验设计与饲养管理

1.3 样品采集

1.4 样品分析与测定

1.5 数据处理

2 结果

2.1 盲肠菌群

2.2 细菌酶活性

2.3 盲肠内容物pH和SCFA浓度

3 讨论

3.1 盲肠菌群

3.2 细菌酶活性

3.3 盲肠SCFA

4 小结

第九章 APN对大鼠小肠粘膜形态和消化酶活性的影响

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验设计与饲养管理

1.3 样品采集与保存

1.4 样品测定

1.5 数据处理

2 结果

2.1 小肠粘膜组织形态

2.2 小肠内容物消化酶活性

2.3 小肠粘膜二糖酶活性

3 讨论

3.1 小肠粘膜组织形态

3.2 小肠内容物消化酶

3.3 小肠粘膜二糖酶的活性

4 小结

提示

创新点

后续研究展望

参考文献

作者简历

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