Dkk1抑制经典Wnt信号通路的分子机制的研究

论文摘要

Wnt信号通路是一条非常保守的信号转导途径,在许多生理过程中都发挥了重要的作用。Dkk（Dickkopf）是Wnt信号通路中重要的拮抗分子之一,能够特异地抑制经典Wnt信号通路。现今有两种模型分别解释Dkk抑制经典Wnt信号的分子机制:在第一种模型中,一些研究者认为Dkk1主要通过在细胞外与配体Wnt竞争受体LRP6从而抑制Wnt信号;在第二种模型中,另一些研究者们则认为在Kremen存在的情况下,Dkk1通过诱导形成Dkk1-LRP6-Kremen三元复合物,并迅速诱导这个三元复合物的内吞从而发挥抑制功能。对于这两种模型一直存在争论。本课题对两种模型分别进行了研究,最终证明两种模型都在Dkk1抑制经典Wnt信号通路过程中发挥了作用,并且两者之间不存在矛盾。我们首次使用半定量免疫染色的方法检测到Dkk1可以特异地抑制Wnt-Frizzled-LRP6三元复合体的形成。通过对于长期效应模型中内吞的分子机制的研究,我们发现Kremen的胞质端不仅对于Dkk1-LRP6-Kremen三元复合物的内吞是必需的,它在辅助Dkk1抑制经典Wnt信号的过程中也发挥了重要作用。并且我们初步确定Dkk1-LRP6-Kremen三元复合体是通过依赖Clathrin内吞途径进行内吞,且AP-2复合体可能是识别此三元复合物的接头蛋白。同时,在实验中我们还发现Kremen不仅可以在不依赖Dkk的情况下与LRP6相互作用,全长的Kremen还可以辅助LRP6转运上膜,这表明Kremen可能在辅助Dkk抑制经典Wnt信号通路的作用外还存在着其它功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 Wnt 信号通路
• 1.1.1 经典Wnt 信号通路
• 1.1.2 Wnt 受体
• 1.1.2.1 Frizzled
• 1.1.2.2 Arrow/LRP5/LRP6
• 1.1.3 Wnt 拮抗分子Dickkopf
• 1.1.4 单跨膜受体Kremen
• 1.2 受体的主要内吞途径
• 1.2.1 依赖Clathrin 的内吞途径
• 1.2.1.1 参与依赖Clathrin 内吞途径的接头蛋白
• 1.2.1.2 货物蛋白上分类信号的识别
• 1.2.1.3 受体内吞与信号转导之间的紧密联系
• 1.2.2 依赖Caveolin 的内吞途径
• 1.2.2.1 Caveolin 家族蛋白
• 1.2.2.2 Caveolae 结构及Caveolae 的内吞
• 1.2.3 Wnt 信号通路中的受体内吞
• 1.3 课题概述
• 第2章 实验材料、试剂和仪器
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验试剂
• 2.3 实验仪器
• 第3章 主要实验方法
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.2 荧光素酶检测实验
• 3.3 细胞免疫染色
• 3.4 Dkk1-Flag 和Wnt8-NFz5-Myc 蛋白的收集和定量
• 3.5 细胞膜表面蛋白结合实验
• 3.6 免疫共沉淀
• 3.7 生物素标记细胞膜表面蛋白
• 3.8 酵母双杂交检测蛋白相互作用
• 第4章 实验结果及讨论
• 4.1 Dkk1 能够竞争性抑制Wnt-NFz5 融合蛋白与受体LRP6 的结合
• 4.1.1 XWnt8-NhFz5 融合蛋白的富集与定量
• 4.1.2 细胞膜表面蛋白半定量染色方法的建立
• 4.1.3 Wnt-NFz 融合蛋白能与细胞膜表面的LRP6 结合且Dkk1 能够竞争性抑制Wnt-NFz 融合蛋白与受体LRP6 的结合
• 4.2 Kremen2 的胞内端对于Dkk1-LRP6-Kremen 三元复合物的内吞是必需的
• 4.2.1 Dkk1-LRP6-Kremen 三元复合物的内吞
• 4.2.2 Kremen2 的胞内端对于三元复合物的内吞是必需的
• 4.2.3 研究三元复合物内吞机制的初步尝试
• 4.2.4 寻找介导三元复合物内吞的接头蛋白的尝试
• 4.3 Kremen2 的胞内端在Dkk1 介导的抑制经典Wnt 信号过程中发挥作用
• 4.4 与Krm2 胞内端相互作用蛋白的筛选
• 4.4.1 使用酵母双杂交技术筛选与Krm2 胞内端相互作用的蛋白
• 4.4.2 部分候选蛋白的再检验
• 4.4.2.1 PIST 与Krm2 相互作用的再检验
• 4.4.2.2 Endophilin B1 与Krm2 相互作用的再检验
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果