论文摘要
环境化学物所致兴奋效应（双相效应），即接触某一化学物低浓度时对机体产生刺激效应，而在高浓度时却产生抑制效应，其剂量-反应关系曲线呈β型和／或U型。近年，Calabrese和Baldwin等学者认为兴奋效应型剂量-反应关系是环境化学物影响机体的主要模型，而并非经典的阈值模型或无阈值线性模型。兴奋效应这一新理论的应用不仅将重新审视毒理学中心法则，而且将引起环境、医学、公共卫生等众多领域发生广泛变革。亚砷酸钠（NaAsO2）是砷（As）元素在环境中存在的主要形式，其不仅分布广泛，而且对机体的影响非常复杂，其既是人类确定致癌物又是多种肿瘤的抗癌药物，然而对其致癌作用和抗癌作用的分子机制目前仍不清楚。国内外已有研究报道不同浓度NaAsO2引起多种细胞增殖与凋亡的兴奋效应，即低浓度引起细胞增殖升高而凋亡降低；相反，高浓度则引起细胞增殖降低而凋亡升高，其分子机制未见研究报道。本研究拟探讨不同浓度NaAsO2处理不同时间对人胚肺成纤维细胞（HELF）增殖和凋亡的影响，以建立NaAsO2所致HELF细胞兴奋效应模型；并探讨JNK和ERK1／2信号通路在NaAsO2所致HELF细胞兴奋效应中的作用；建立JNK缺陷细胞株，为进一步探讨JNK信号通路在NaAsO2所致细胞兴奋效应中的作用提供条件。从而揭示NaAsO2所致细胞兴奋效应的部分分子机制，并为进一步理解和接受环境化学物所致兴奋效应及其应用、全面了解砷化物对细胞的影响提供一定的科学依据。方法一、NaAsO2对HELF细胞增殖和凋亡的影响分别用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μmol／L NaAsO2处理HELF细胞3、6、12、24和48h后，分别用MTT法检测HELF细胞增殖率和用Hoechst 33258法检测HELF细胞凋亡率，寻找其剂量-效应和时间-效应关系。二、NaAsO2对HELF细胞磷酸化JNK和ERK1／2表达水平的影响分别用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μmol／L NaAsO2处理HELF细胞3、6、12、24和48h，收集HELF细胞蛋白，用Western blot检测HELF细胞JNK、磷酸化JNK、ERK1／2和磷酸化ERK1／2表达水平。并用同一张膜上相应泳道的β-actin条带的灰度进行校正。三、JNK和ERK1／2抑制剂对NaAsO2所致细胞增殖与凋亡的影响预先用20μmol／L JNK抑制剂SP600125或100μmol／L ERK1／2抑制剂PD98059处理HELF细胞30min，然后分别用0.0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μmol／L NaAsO2处理HELF细胞24h，分别检测HELF细胞增殖率和凋亡率。四、JNK缺陷HELF细胞株建立及生物学特性观察从HELF细胞中抽提总RNA，用RT-PCR法扩增目的DNA片段，经重组技术构建JNK基因反义RNA绿色荧光真核表达质粒，将重组质粒转染HELF细胞，经G418筛选后，用Western blot检测JNK蛋白含量，确认获得JNK缺陷HELF细胞株后，观察比较JNK缺陷HELF细胞和正常HELF细胞的生长形态和生长曲线。结果一．NaAsO2对HELF细胞增殖和凋亡的影响（一）NaAsO2对HELF细胞增殖的影响HELF细胞相对增殖率在处理12和48h时0.5μmol／L NaAsO2组显著高于对照组（P均＜0.05），在处理24h时0.1和0.5μmol／LNaAsO2组均显著高于对照组（P均＜0.01），其增殖高峰表现在0.5μmol／L NaAsO2组；在处理24和48h时5.0和10.0μmol／L NaAsO2组均显著低于对照组（P均＜0.01）。结果显示NaAsO2低浓度可引起HELF细胞明显增殖，而高浓度则抑制HELF细胞生长，其剂量-效应曲线呈β型。（二）NaAsO2对HELF细胞凋亡的影响HELF细胞凋亡率在处理3、6、12、24和48h时0.5μmol／L NaAsO2组均显著低于对照组（P均＜0.01）；而在处理24h时5.0和10.0μmol／LNaAsO2组显著高于对照组（P均＜0.01）；在处理48h时5.0μmol／L NaAsO2组显著高于对照组（P＜0.01）。结果显示低浓度NaAsO2引起HELF细胞凋亡率明显降低，而在高浓度NaAsO2引起细胞凋亡率明显升高，其剂量-效应曲线呈U型。二．NaAsO2对HELF细胞磷酸化JNK和ERK1／2表达水平的影响（一）NaAsO2对HELF细胞磷酸化JNK表达水平的影响HELF细胞磷酸化JNK表达水平在处理3、6和12h时0.1、0.5和10.0μmol／L NaAsO2组均明显高于对照组；在处理24h时5.0和10.0μmol／LNaAsO2组明显高于对照组。结果显示低浓度和高浓度NaAsO2处理HELF细胞不同时间引起JNK不同程度激活，而中间浓度NaAsO2处理HELF细胞不同时间则不引起JNK激活。（二）NaAsO2对HELF细胞磷酸化ERK1／2表达水平的影响HELF细胞磷酸化ERK1／2表达水平在处理6和12h时0.1、0.5、1.0、5.0和10.0μmol／L NaAsO2组分别明显高于对照组；在处理24h时5.0和10.0μmol／L NaAsO2组明显高于对照组。结果显示不同浓度NaAsO2处理HELF细胞不同时间引起ERK1／2激活，但各剂量组之间无明显差别。三、JNK和ERK1／2抑制剂对NaAsO2所致细胞增殖和凋亡的影响（一）JNK和ERK1／2抑制剂对NaAsO2所致细胞增殖的影响HELF细胞增殖率在用JNK抑制剂SP600125处理时0.1和0.5μmol／LNaAsO2组显著低于同一浓度无抑制剂组（P分别＜0.05，＜0.01），10.0μmol／LNaAsO2组显著高于同一浓度无抑制制组（P＜0.05）；在用ERK1／2抑制剂PD98059处理时0.1和0.5μmol／L NaAsO2组显著低于同一浓度无抑制剂组（P分别＜0.05，＜0.01），10.0μmol／L NaAsO2组显著低于同一浓度无抑制制组（P＜0.05）。结果显示JNK抑制剂SP600125可明显拮抗不同浓度NaAsO2所致HELF细胞增殖的兴奋效应；而ERK1／2抑制剂PD98059则明显拮抗低浓度NaAsO2产生的细胞增殖升高，但其使高浓度NaAsO2产生的细胞增殖更低。（二）JNK和ERK1／2抑制剂对NaAsO2所致细胞凋亡的影响HELF细胞凋亡率在用JNK抑制剂SP600125处理时0.5μmol／LNaAsO2组显著高于同一浓度无抑制剂组（P＜0.05），5.0和10.0μmol／LNaAsO2组反而显著低于对照组和同一浓度无抑制剂组（P均＜0.01）；在用ERK1／2抑制剂PD98059处理时0.1和0.5μmol／L NaAsO2组仍显著低于对照组（P分别＜0.05，＜0.01），5.0和10.0μmol／L NaAsO2组仍显著高于对照组（P均＜0.01），而其与同一浓度无抑制剂组均无显著性差别（P均＞0.05）。结果显示JNK抑制剂SP600125可明显拮抗不同浓度NaAsO2所致HELF细胞凋亡的兴奋效应，而ERK1／2抑制剂PD98059则对此作用无明显影响。四、JNK缺陷HELF细胞株建立及生物学特性观察（一）JNK基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体的构建pEGFP-C1-asJNK（top）和pEGFP-C1-asJNK（mid）两种重组质粒，经酶切鉴定分别获得387bp和326bp DNA片段；测序结果与GenBank中的JNKDNA序列符合率均为100％。结果表明成功构建两种JNK反义RNA真核表达载体。（二）JNK缺陷HELF细胞鉴定Western blot方法检测C1-HELF、asJNK-HELF（top）和sJNK-HELF（mid）三种细胞中的JNK蛋白水平，发现asJNK-HELF（top）细胞中JNK蛋白含量比C1-HELF细胞降低了59％，asJNK-HELF（mid）细胞中JNK蛋白含量比C1-HELF细胞降低了87％。说明成功建立JNK缺陷HELF细胞，且asJNK-HELF（mid）细胞JNK抑制效果比asJNK-HELF（top）更佳。（三）JNK缺陷HELF细胞生物学特性观察asJNK-HELF（top）、asJNK-HELF（mid）和C1-HELF三种细胞在转染初期，细胞形态出现一定变化，但随着传代及载体稳定表达，转染细胞形态逐渐与HELF细胞一致。HELF、C1-HELF、asJNK-HELF（top）和asJNK-HELF（mid）四种细胞生长曲线相似，无明显差别，均呈“S”型，提示单独JNK蛋白缺陷尚不足以引起HELF细胞的生长速度发生改变。结论1．不同浓度NaAsO2引起HELF细胞增殖与凋亡的变化呈兴奋效应（双相效应）。2．JNK信号通路和ERK1／2信号通路在不同浓度NaAsO2引起HELF细胞增殖与凋亡的兴奋效应中发挥重要作用，其中JNK信号通路比ERK1／2信号通路发挥更重要的作用。3．成功建立两种JNK缺陷HEFL细胞，其中asJNK-HELF（mid）细胞JNK抑制效果比asJNK-HELF（top）细胞更佳。
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标签：亚砷酸钠论文; 兴奋效应论文; 细胞增殖论文; 细胞凋亡论文; 人胚肺成纤维细胞论文;