乳酸克鲁维酵母糖基工程研究

乳酸克鲁维酵母糖基工程研究

论文摘要

包括基因工程抗体在内的糖蛋白药物,是今后基因工程药物发展的主体,但与其快速增长的需要相比,糖蛋白的生产能力却明显不足。至今,哺乳动物细胞还是唯一能完成类似于人的复杂型糖基修饰的糖蛋白药物表达系统,但该表达系统存在的高成本,难放大等问题,已严重阻碍了治疗性糖蛋白药物产业的发展。酵母作为最简单的真核生物,虽然具有培养成本低廉,可高密度发酵和大规模生产等优点,但它合成的糖蛋白糖基是高甘露糖型结构,这种糖基结构在体内存在易被清除、高免疫原性等问题,因而一般不能作为治疗用药物。酵母糖基的人源化改造目的正是解决这一关键问题,它是指在酵母细胞内模拟合成具有类似于哺乳动物细胞的复杂型糖基结构。国内外的该领域相关研究都集中在酿酒酵母和毕赤酵母中,作为“四大酵母表达系统”之一的乳酸克鲁维酵母(K. lactis)的糖基工程研究还未见报道,K. lactis除具有营养要求低、生长快、可对外源蛋白进行糖基化修饰等酵母共有特点外,还具有遗传背景清楚,表达水平高,表达系统安全、大规模发酵工艺成熟等诸多优点,因此本研究首次开展了对K. lactis糖基人源化改造的研究。1.在K. lactis中,建立了KlURA3基因为筛选标记的营养缺陷型菌株和两步基因重组技术。以K. lactis ATCC8585原养型菌株作为起始菌株,建立了高效敲除K. lactis目的基因的两步基因重组技术,成功敲除KlURA3基因,获得URA3基因缺失的营养缺陷型菌株KLGE01(ura3Δ)。利用URA3作为筛选标记和两步基因重组技术,实现ura3营养缺陷型筛选标记的重复循环利用,为酵母糖基工程多个糖苷酶或糖基转移酶基因的引入解决了筛选标记不足的难题。2.建立了och1Δ、mnn1Δ双缺陷K. lactis菌株和低糖化表达系统。成功敲除了K. lactis的α-1,6-甘露糖转移酶OCH1基因,以及可能编码α-1,3-甘露糖转移酶的KlMNN1基因,并利用och1Δ、mnn1Δ双缺陷菌株作为宿主,表达了糖蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白),发现其过度糖基化和不均一性明显降低,说明K. lactis自身的过度甘露糖化已被阻断。3.首次获得了表达糖蛋白糖基结构为Man9GlcNAc2的K. lactis。利用荧光糖电泳(FACE)和DNA测序仪辅助毛细管电泳(DSA-FACE)方法,对K. lactis野生型菌株、单缺陷型菌株och1Δ、双缺陷型菌株och1Δ&mnn1Δ表达HSA/GM-CSF的N-糖基进行分析,结果发现:野生型菌株所表达糖蛋白的N-糖基大于Man30GlcNAc2;单缺陷型菌株och1Δ表达蛋白的N-糖基为Man1314GlcNAc2,Man13GlcNAc2占主要成份;双缺陷型菌株och1Δ&mnn1Δ表达蛋白的N-糖基为Man911GlcNAc2,Man9GlcNAc2占主要成份,该结构为内质网核心寡糖结构。表明KlOCH1是引起酵母过度糖基化的关键起始酶,KlMNN1也共同参与了酵母过度甘露糖化的形成,具有一定的甘露糖转移酶活性,同源比对发现KlMNN1基因序列与酿酒酵母α1,3-甘露糖转移酶ScMNN1基因同源,推测其可能编码α-1,3-甘露糖转移酶。4.首次在K. lactis中获得哺乳动物细胞复杂型糖基合成关键结构Man5GlcNAc2。首先通过同源比对克隆了可能编码拟南芥α1,2-甘露糖苷酶I(MANI)的基因,同时克隆了来源于人和绿色木霉的MANI基因,然后通过与S. cerevisiae、K. lactis的ER-MNSI基因、SEC12基因内质网定位信号和HDEL内质网四肽定位信号进行融合,最终获得13种MANI融合基因。比较其对糖基的作用,发现表达“ER-ScMNSI signal+human MANI(Δ63)”的宿主中,有少量Man5GlcNAc2结构,以Man9~11GlcNAc2结构为主;表达“ScSEC12 signal+ATMANI(Δ48)”宿主中,得到Man5GlcNAc2结构,但同时存在Man6~8GlcNAc2和Man9~11GlcNAc2结构;表达ER-ScMNSI signal+ATMANI(Δ48)宿主中,以Man6GlcNAc2结构为主,但同时存在Man7~8GlcNAc2结构。结果说明预测的拟南芥MANI具有α1,2-甘露糖苷酶活性,能够将Man9GlcNAc2结构加工成哺乳动物的甘露糖型结构Man5GlcNAc2,活性甚至高于人和绿色木霉的MANI活性。总之,首次对K. lactis进行了糖基工程改造,成功阻断其自身高甘露糖化合成途径,获得了低糖化表达系统;并在K. lactis细胞内获得了哺乳动物的甘露糖型结构—Man5GlcNAc2;初步解决了筛选标记不足的难题;建立了用于糖基工程的DSA-FACE糖基分析方法,从而为获得具有杂合型和复杂型糖基合成能力的K. lactis研究奠定了基础。在K. lactis中获得Man5GlcNAc2结构具有重要意义,这是因为通常酵母细胞内具有的最低甘露糖型结构是Man8GlcNAc2,而Man5GlcNAc2结构是哺乳动物细胞的甘露糖型结构,是合成杂合型和复杂型糖基的基础结构,该结构的获得不仅证明了在K. lactis中可以得到哺乳动物的甘露糖型结构,而且还为进一步合成杂合型糖基GlcNAcMan5GlcNAc2或复杂型糖基提供了核心糖基结构,Man5GlcNAc2结构的获得是酵母迈向哺乳动物细胞N-糖基化修饰的转折点。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • (一) 乳酸克鲁维酵母表达系统
  • (二) 酵母和哺乳动物细胞N-糖基化修饰途径
  • (三) 酵母糖基人源化研究进展及意义
  • (四) 本研究的目的
  • 第一部分 乳酸克鲁维酵母URA3 营养缺陷型菌株的构建
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 菌株、质粒和细胞
  • 1.1.2 工具酶、抗体及分子量标准
  • 1.1.3 主要试剂及试剂盒
  • 1.1.4 主要仪器及配件
  • 1.1.5 主要培养基和溶液
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 K. lactis URA3 基因敲除载体的构建
  • 1.2.2 K. lactis URA3 基因的敲除
  • 1.3 结果
  • 1.3.1 用于敲除K. lactis URA3 基因载体的构建及其鉴定
  • 1.3.2 K. lactis URA3 基因的敲除及其鉴定
  • 第二部分 乳酸克鲁维酵母低糖化表达系统的建立 — OCH1、MNN1 基因的敲除
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 菌株、质粒和细胞
  • 2.1.2 工具酶、抗体及分子量标准
  • 2.1.3 主要试剂及试剂盒
  • 2.1.4 主要仪器及配件
  • 2.1.5 主要培养基
  • 2.1.6 主要溶液
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 K. lactis OCH1 基因敲除菌(Kloch1Δ)的构建
  • 2.2.2 K. lactis OCH1 基因的敲除及其鉴定
  • 2.2.3 K. lactis MNN1 基因敲除菌(Kloch1Δ、mnn1Δ)的构建
  • 2.2.4 K. lactis MNN1 基因的敲除及其鉴定
  • 2.2.5 HSA/GM-CSF 表达载体的构建
  • 2.2.6 HSA/GM-CSF 在乳酸克鲁维酵母野生型和缺陷型菌株中的表达
  • 2.2.7 HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的FACE 分析
  • 2.2.8 HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的DSA-FACE 分析
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 用于敲除K. lactis OCH1 或MNN1 基因载体的构建及其鉴定
  • 2.3.2 K. lactis OCH1 基因的敲除及其鉴定
  • 2.3.3 K. lactis MNN1 基因的敲除及其鉴定
  • 2.3.4 HSA/GM-CSF 基因的获得
  • 2.3.5 pKLAC1/HSA/GM-CSF 表达载体的构建
  • 2.3.6 HSA/GM-CSF 在乳酸克鲁维酵母中的表达及纯化
  • 2.3.7 HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖基分析
  • 第三部分 α-1,2-甘露糖苷酶I 在K. lactis KLGE03 菌株内的定位和高效表达
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 植株、菌株和质粒
  • 3.1.2 工具酶、抗体及分子量标准
  • 3.1.3 主要试剂、主要仪器及配件
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 α-1,2-甘露糖苷酶I(MANI)基因的获得
  • 3.2.2 MANI 基因定位信号的钓取
  • 3.2.3 MANI 表达载体的构建
  • 3.2.4 乳酸克鲁维酵母KLGE03(HSA/GM-CSF)的转化
  • 3.2.5 pYES2/och1-LAC4-Signal-MANI 酵母转化子的鉴定
  • 3.2.6 K. lactis KLGE03-GM-MANI 转化子诱导表达及报告蛋白的纯化
  • 3.2.7 HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的FACE 分析
  • 3.2.8 HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的DSA-FACE 分析
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 α-1,2-甘露糖苷酶I(MANI)基因的获得
  • 3.3.2 定位信号的获得
  • 3.3.3 强启动子LAC4 的获得
  • 3.3.4 MANI 表达载体的构建及其鉴定
  • 3.3.5 MANI 的表达及报告蛋白HSA/GM-CSF 的纯化
  • 3.3.6 MANI 活性鉴定
  • 3.3.7 小结
  • 结论
  • 讨论
  • 5GlcNAc2 结构的获得为K. lactis 人源化糖基改造提供了重要基础'>1. Man5GlcNAc2 结构的获得为K. lactis 人源化糖基改造提供了重要基础
  • 2. KlOCH1 和KlMNN1 的双敲除提供了一种新型的低糖化表达系统
  • 3. 两步基因重组技术提供了高效、可重复利用筛选标记来敲除敲入目的基因的方法
  • 4. N-糖链分析技术是酵母糖基工程高通量和快速筛选的基础
  • 附录
  • 1. 主要引物设计序列表
  • 2. 菌株基因型表
  • 3. 缩略词表
  • 参考文献
  • 致谢
  • 相关论文文献

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