鲤鱼（Cyprinus carpio L.）肠粘液细胞对血清IgM转运机制的初步研究

论文摘要

本研究以我国常见的鲤鱼（Cyprinus carpio L.）为材料,首先纯化鲤鱼血清IgM,然后利用纯化的鲤鱼血清IgM 制备亲和层析柱,获得鲤鱼肠上皮细胞膜IgM 受体分子（简称fpIgR）,再以fpIgR 为抗原制备豚鼠抗血清（简称Anti-fpIgR）,利用免疫荧光标记技术对该IgM 受体分子的分布进行观察和分析。采用SephadexG-200 凝胶层析和MBP 亲和层析方法分离纯化鲤鱼血清IgM,分子量约885kDa。利用SDS-PAGE 和HPLC 对其进行初步分析,结果表明,血清IgM可以解离形成重链和轻链,分子量分别是82kDa 和29kDa。利用凝胶层析纯化的鲤鱼血清IgM 制备亲和层析柱,获得了鲤鱼肠上皮细胞膜IgM 受体fpIgR,SDS-PAGE 和HPLC 检测结果表明,该受体分子的分子量为43kDa,HPLC 检测呈现一个主峰。将纯化的fpIgR 与血清IgM 过夜孵育后再进行HPLC 检测,结果表明,纯化的肠上皮细胞膜IgM 受体fpIgR 仍具有与血清IgM 结合的能力。利用不同的荧光标记物对鲤鱼肠组织和脾脏淋巴细胞进行免疫荧光标记。对肠组织的标记分为三个部分。首先,利用FITC 标记鲤鱼血清IgM（简称FITC-IgM）,观察发现,鲤鱼肠组织中含有较多粘液细胞的上皮细胞层具有对其血清IgM 的结合性,此外,粘膜固有层也具有部分结合性;其次,利用亲和纯化的fpIgR免疫豚鼠制备抗血清Anti-fpIgR,二抗采用FITC 标记的羊抗豚鼠全分子抗体进行间接免疫荧光标记。结果表明,鲤鱼肠组织中具有该受体分子fpIgR,且其分布与鲤鱼肠粘液细胞的分布一致;再次,利用Anti-fpIgR 封闭鲤鱼肠组织后,再进行FITC-IgM 标记,结果表明,封闭后的肠组织对IgM 的结合能力大大降低。综合上述结果可知,在肠组织中参与IgM 结合的主要为fpIgR,此外,在肠组织粘膜固有层也有部分染色,可能是其中含有的弥散的淋巴组织造成的,它们能结合IgM,并且其结合方式可能与淋巴细胞相似。对鲤鱼脾脏淋巴细胞的标记分为两个部分。第一,FITC-IgM 标记显示,鲤鱼脾脏淋巴细胞能结合IgM,而红细胞则不行;第二,Anti-fpIgR 及其荧光标记二抗对鲤鱼脾脏淋巴细胞进行标记,结果表明,脾脏中的淋巴细胞和红细胞均不能被染色,说明由亲和纯化得到的鲤鱼肠上皮细胞膜上fpIgR 并不存在于脾脏淋巴细胞表面。脾脏细胞的上述标记结果表明,鲤鱼脾脏淋巴细胞表面参与IgM 结合的不是fpIgR。综上所述,纯化得到的IgM 受体分子fpIgR 只存在于鲤鱼肠上皮细胞,不同于脾脏淋巴细胞表面的IgM 受体分子。本研究通过亲和层析方法获得的鲤鱼肠上皮细胞膜IgM 受体分子在鲤鱼的粘

论文目录

• 摘要
• 英文缩写词
• 综述:免疫球蛋白转运机制的研究
• 一鱼类免疫球蛋白的研究
• 二免疫球蛋白转运的研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 蛋白纯化常用试剂及试剂盒
• 2.1.4 膜受体纯化常用试剂
• 2.1.5 电泳常用试剂
• 2.1.6 免疫组化常用试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 鲤鱼血清IgM 的提取纯化
• 2.2.2 鲤鱼肠上皮细胞膜IgM 受体的亲和纯化
• 2.2.3 鲤鱼肠组织及脾脏细胞的免疫荧光标记
• 3 结果
• 3.1 鲤鱼血清 IGM 的纯化和检测
• 3.1.1 凝胶层析纯化鲤鱼血清IgM 及检测
• 3.1.2 MBP 亲和纯化鲤鱼血清IgM 及检测
• 3.2 鲤鱼肠上皮细胞膜 IGM 受体分子的纯化和检测
• 3.2.1 鲤鱼肠上皮细胞膜全蛋白的检测
• 3.2.2 鲤鱼肠上皮细胞膜IgM 受体的纯化及检测
• 3.2.3 鲤鱼肠上皮细胞膜IgM 受体的HPLC 检测
• 3.3 鲤鱼肠组织及脾脏细胞的免疫荧光标记
• 3.3.1 鲤鱼肠组织的H.E.染色
• 3.3.2 鲤鱼肠组织的 AB-PAS 染色
• 3.3.3 鲤鱼肠组织的FITC-IgM 荧光标记
• 3.3.4 鲤鱼肠组织的Anti-fpIgR 间接荧光标记
• 3.3.5 鲤鱼肠组织经Anti-fpIgR 封闭后的FITC-IgM 荧光标记
• 3.3.6 鲤鱼脾脏细胞的FITC-IgM 荧光标记
• 3.3.7 鲤鱼脾脏细胞的Anti-fpIgR 间接荧光标记
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表文章