论文摘要
一、研究背景:胰腺癌是一种恶性程度很高的恶性肿瘤,发病率在国内外均呈上升趋势,目前居消化道癌症死因的第2位,5年生存率低于4%。早期的侵袭和转移是胰腺癌的重要特征以及不良预后的关键因素。目前认为,信号分子的异常激活在肿瘤侵袭转移中起重要作用,其中,以非受体酪氨酸激酶Src超家族及相关信号分子的活化尤为瞩目。非受体酪氨酸激酶Src超家族是由Src、Fyn、Yes、Lyn等成员组成的,该超家族在细胞的增殖、分化、有丝分裂、凋亡等过程中起非常重要的作用。研究显示几乎所有的实体瘤均存在Src的高表达及过度激活,并与肿瘤的发生发展密切相关。而作为Src家族成员之一的Fyn,可见于脑肿瘤及头颈部肿瘤中表达增高的相关报道,提示Fyn亦可以参与肿瘤侵袭转移。然而,目前尚未见Fyn参与胰腺癌侵袭转移及其分子机制的相关研究。在肿瘤侵袭转移的过程中,瘤细胞需要从原位脱落进入血液循环而到达靶器官,只有具备抗失巢凋亡特性的肿瘤细胞才能在靶器官中生长,并最终形成转移灶。因此,对凋亡的调控可以直接影响肿瘤细胞的侵袭转移能力。尽管目前的研究普遍认为,非受体酪氨酸激酶能够通过调控细胞凋亡,进而影响肿瘤侵袭转移,但具体的机制仍不清楚。肿瘤细胞抗失巢凋亡的本质是相关信号分子异常活化,影响细胞内凋亡相关基因的表达。在众多的凋亡相关基因中,由于Bcl-X能够在不同情况下,经选择性剪切形成两种作用相互拮抗的产物,因而备受关注。Bcl-X是Bcl-2家族成员,该基因转录后经过不同的剪切方式形成Bcl-X（L）和Bcl-X（s）两种剪切体。其中Bcl-X（L）表现出明显的抗凋亡作用;而Bcl-X（s）缺少了与Bcl-2具有高度同源性的63个氨基酸,表现出促进凋亡的作用。然而,Bcl-X基因发生选择性剪切的机制尚不清楚。目前研究认为酪氨酸激酶Fyn并不能直接参与RNA剪切的调控。Fyn作为一个多功能的激酶,可以通过其蛋白质结构域与下游信号分子结合并发挥作用,实现对靶基因的调控。值得注意的是,非受体酪氨酸激酶Src超家族与RNA结合蛋白hnRNPs（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,核内不均一性核糖核蛋白）、Sam68之间存在着相互作用。hnRNPs、Sam68可以作为非受体酪氨酸激酶的底物,受到激活后,通过结合在基因的Pre-mRNA序列上,在转录后水平进行调控,从而影响细胞的生物学行为。综合近年来国内外的研究结果,我们设想蛋白酪氨酸激酶Fyn通过激活结合于Bcl-X基因Pre-mRNA序列上的Sam68、hnRNP A2/B1两个RNA结合蛋白,参与Bcl-X的选择性剪切,改变Bcl-X两种功能相互拮抗的剪切体比例,影响细胞凋亡,调控胰腺癌的侵袭转移。二、目的本实验的目的主要分为两个部分,一方面是明确非受体酪氨酸激酶Fyn在胰腺癌侵袭转移中的作用;另一方面是探究Fyn是否通过激活其下游靶信号分子hnRNPA2/B1、Sam68,从而参与Bcl-X基因的选择性剪切的调控,并阐明其分子机制。明确以上信号通路及调控机制将有助于深入理解胰腺癌侵袭转移的分子机制,并为寻找干预胰腺癌侵袭转移的靶点提供帮助,最终将有助于改善胰腺癌患者的预后。三、材料与方法1、通过免疫组化、Real-Time PCR的方法对28例胰腺癌Fyn的表达情况进行分析,并明确其与胰腺癌临床病理参数之间关系。用放射性同位素p32标记的方法对三种侵袭转移能力不同的胰腺癌细胞进行Fyn激酶活性测定,明确Fyn活性与胰腺癌侵袭转移能力之间的关系。2、将携带激酶活性缺失的KD-Fyn（Kinase Dead-Fyn）的腺病毒转染BxPC3胰腺癌细胞,用放射性同位素p32标记的方法进行Fyn激酶活性测定。MTT、Transwell侵袭实验、TUNEL法分别检测抑制Fyn活性前后BxPC3细胞增殖、侵袭能力以及凋亡水平的改变。RT-PCR检测Bcl-X基因两种剪切体比例的变化。并进一步将转染KD-Fyn前后的BxPC3细胞注射于裸鼠皮下,制作裸鼠成瘤模型,通过对胰腺癌肝脏转移情况的观察,在体明确抑制Fyn活性对BxPC3细胞侵袭转移能力的影响。3、将转染KD-Fyn前后的BxPC3细胞进行聚丙酰胺二维凝胶电泳,并通过质谱分析,寻找出蛋白质差异点。通过Western-Blot的方法,对转染KD-Fyn前后BxPC3细胞中该蛋白的表达水平进行检测。采用磷酸化的蛋白抗体PY20,对转染KD-Fyn前后Sam68的磷酸化水平进行检测。并通过免疫共沉淀的方法,检测Fyn与筛选出的差异蛋白、Sam68是否存在细胞内结合关系。4、通过免疫组化的研究方法对26例胰腺癌hnRNP A2/B1的表达情况进行分析,并明确其与胰腺癌临床病理参数之间的关系。通过RNA-免疫共沉淀技术,检测筛殉龅牟钜斓鞍議nRNP A2/B1是否与Bcl-X基因的Pre-mRNA结合并证实磷酸化水平变化对Sam68的Bcl-X结合能力的影响。构建重组hnRNP A2/B1及hnRNP A2/B1 RNAi腺病毒载体,并通过改变hnRNP A2/B1的表达水平,观察对Bcl-X两种剪切体比例的影响。五、结果及结论1、28例胰腺癌组织标本中有24例出现Fyn的表达,表达水平与胰腺癌TNM分期、是否发生远处转移相关,而与肿瘤大小、分化程度没有明显的关系。在BxPC3、Paca2、Aspc1三种侵袭转移能力不同的胰腺癌细胞中,Fyn的活性与侵袭转移能力呈正相关。以上结果证实:Fyn胰腺癌侵袭转移密切相关。2、转染KD-Fyn以后,Fyn激酶活性明显下降。MTT证实,抑制Fyn活性,明显抑制了胰腺癌细胞增殖;Transwell实验证实,抑制Fyn活性,明显降低了胰腺癌细胞侵袭运动能力。TUNEL染色显示,抑制Fyn活性,BxPC3胰腺癌细胞凋亡发生率明显增加。在裸鼠成瘤实验中,抑制Fyn活性可以明显抑制BxPC3胰腺癌细胞在裸鼠中的成瘤能力。RT-PCR证实,抑制Fyn活性明显改变了凋亡相关基因Bcl-X的选择性剪切方式,其中促进凋亡的Bcl-X（s）明显增加,抑制凋亡的Bcl-X（L）明显降低。以上结果揭示了当抑制Fyn的激酶活性,可以下调胰腺癌细胞的侵袭转移能力,而这种作用是通过影响Bcl-X基因选择性剪切方式改变,进而影响胰腺癌细胞凋亡实现的。3、聚丙酰胺二维凝胶电泳筛选出了转染KD-Fyn前后的BxPC3细胞中表达量发生改变的多个差异点蛋白,免疫共沉淀技术证实其中的差异点蛋白hnRNP A2/B1及另一个RNA结合蛋白Sam68能够分别与Fyn结合。Western-Blot证实,抑制Fyn的活性,hnRNP A2/B1表达水平下降;Sam68的磷酸化水平下降。以上结果证实:Fyn可以结合并调控其下游靶信号分子hnRNP A2/B1的蛋白表达水平及Sam68的磷酸化水平。4、将hnRNP A2/B1基因及hnRNP A2/B1 RNAi质粒成功克隆入Ad-Easy腺病毒载体中,获得包含hnRNP A2/B1及hnRNP A2/B1 RNAi的重组腺病毒。该腺病毒可以高效干预hnRNP A2/B1在BxPC3胰腺癌细胞中的表达。5、28例胰腺癌组织标本中有23例出现hnRNP A2/B1的表达,表达水平与胰腺癌TNM分期、是否发生远处转移相关等因素有关,而与肿瘤部位、分化程度等没有明显的关系。RNA-免疫共沉淀证实,hnRNP A2/B1、Sam68能够与BxPC3细胞中Bcl-X基因的Pre-mRNA结合。磷酸化水平的改变可以影响Sam68与Bcl-X基因的结合能力;而hnRNP A2/B1表达水平的改变可以影响BxPC3胰腺癌细胞中Bcl-X两种剪切体的比例综合以上实验结果,我们发现了Fyn—hnRNP A2/B1-Sam68—Bcl-X信号通路,即酪氨酸激酶Fyn通过分别结合并影响下游靶蛋白hnRNP A2/B1的表达水平及Sam68的磷酸化水平,参与Bcl-X基因选择性剪切,改变Bcl-X两种功能相互拮抗的剪切体比例,影响细胞凋亡,最终调控胰腺癌侵袭转移。
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